堅忍腸球菌6-24 和枯草芽孢桿菌B9 對羅氏沼蝦免疫水平與腸道環境的改善作用

朱成坤，秦振寧，韓雙艷，梁書利，林影

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣東省發酵與酶工程重點實驗室，廣東廣州 510006）

羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）屬于長臂蝦科、沼蝦屬動物，又名馬來西亞大蝦、淡水長臂大蝦、大頭蝦等，是一種大型淡水經濟蝦類，素有淡水蝦王之稱。羅氏沼蝦原產于東南亞（大部分產于馬來西亞），現在已被引進到全球各地，成為全球養殖產量最高的三大蝦種之一[1]。近年來，在廣東省整體漁業的出塘總量以及出塘總收入逐年下降的情況下，羅氏沼蝦的出塘量及其帶來的收益在逐年上升，表明羅氏沼蝦對廣東省水產行業的經濟貢獻巨大[2]。為了提高產量和產值，高密度養殖成為養殖場的常用方法，但也出現了不少問題。養殖密度的增加常常使得水質惡化、營養鹽缺乏，導致蝦機體免疫力下降、感染病毒和細菌的機率大大增加，蝦體發病甚至死亡，出塘率顯著降低[3]。為此，人們開始引入抗生素類的化學藥品，但這也導致了細菌耐藥性產生、蝦體腸道正常菌群擾亂、食物鏈攝入導致食用者體內抗生素積累、以及環境中抗生素殘留等諸多問題[4,5]。近年來，隨著微生物修復的概念普及，人們嘗試在水產飼料中引入益生菌減少化學藥物的使用，提高蝦體自身免疫力，促進整個蝦類養殖業的健康綠色發展。

益生菌具有調節水產動物體內的微生態平衡，刺激免疫功能等作用，因而有利于恢復動物機體正常生理功能、防治病害、增進健康，從而使養殖動物的生產性能提高[6,7]。Lin 等[8]發現在飼料中添加濃度均為1×109cfu/kg-的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisE20），戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus BD6），釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeP13）以及發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentumLW2）能夠改善鱸魚的免疫參數和生長狀況，同時還能夠降低嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的數量。除了水產魚類，益生菌也在飼養凡納濱對蝦中也有初步應用。張盛靜等[9]研究發現，在飼料中添加地衣芽孢桿菌可顯著提高凡納濱對蝦抗哈維氏弧菌感染的能力，汪波等[10]研究則表明，添加凝結芽孢桿菌也可在一定程度上提高凡納濱對蝦幼蝦的生長性能和改善其非特異性免疫力。但上述研究主要集中于研究外源益生菌添加對蝦體生長及免疫力的影響。同時，學者們普遍認為，不同種類的益生菌對機體的作用機制不同，復合添加通常能夠達到作用互補或增強的效果[11]。理論上來講，內源益生菌較外源益生菌對宿主蝦體的作用更加溫和，適應性更好。近幾年，人們開始嘗試從蝦體自身消化道分離內源性微生物，但對分離的內源益生菌用于飼喂，研究對蝦的生長性能以及免疫的影響比較少。本研究嘗試從抑菌作用、腸道粘附性以及產酶能力三個方面從蝦腸道篩選分離內源益生菌，并將分離鑒定的內源益生菌用于制備發酵飼料，分析該添加飼料對羅氏沼蝦腸道環境和免疫功能的影響，為內源益生菌在羅氏沼蝦養殖中的應用推廣及快速普及提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

羅氏沼蝦，活體，28.84±5.09 g，共120 條，購于東莞市江南水產批發市場，活體運回。

1.1.2 實驗材料與試劑

副溶血弧菌ATCC17802 購自環凱生物科技有限公司；商業南美白對蝦1 號料購自通威股份有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、溶菌酶（lysozyme，LZM）測定試劑盒購自南京建城生物工程研究所；乳酸菌培養基（MRS）、營養肉湯培養基（NB）、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖培養基（TCBS）、胰酪大豆胨培養基（TSB）培養基購自環凱生物科技有限公司；L-3,4 二羥基苯丙氨酸（L-DOPA），棕櫚酸對硝基苯酯（p-NPP）、多粘菌素B 購自阿拉丁公司；促芽孢培養基：2%（m/V）胰蛋白胨、3%（m/V）葡萄糖、0.4%（m/V）K2HPO4、0.4%（m/V）NaH2PO4、0.1%（m/V）MgSO4、0.5%（m/V）(NH4)2SO4、0.05%（m/V）MnSO4、0.02%（m/V）CaCl2、0.8%（m/V）酵母提取物，pH 7.2；淀粉酶篩選培養基：1%（m/V）胰蛋白胨，0.3%（m/V）牛肉浸膏，0.5%（m/V）無水氯化鈉，0.2%（m/V）可溶性淀粉，2%（m/V）瓊脂，pH 7.2；蛋白酶篩選培養基：1%（m/V）蛋白胨，1%（m/V）牛肉浸膏（m/V），0.5%（m/V）無水氯化鈉，1%（m/V）干酪素，2%（m/V）瓊脂；木聚糖酶篩選培養基：1%（m/V）木聚糖，1.8%（m/V）NB 培養基，2%（m/V）瓊脂。

1.2 內源益生菌分離實驗

1.2.1 乳酸菌分離純化

蝦的體表用75%的乙醇清洗和消毒。在無菌條件下，使用鑷子和剪刀解剖整個腸子并浸泡在PBS 7.2中。使用勻漿機將腸子進行勻漿。將勻漿液進行連續稀釋（10-1至10-6）并涂布在MRS 平板上，在厭氧條件下于37 ℃培養24 h。培養結束后隨機挑出一個菌落重新劃線于新的MRS 平板，重復3 次以獲得純培養物。將純化的菌株保存在含有15%無菌甘油的MRS肉湯中，并保存在-80 ℃待用。

1.2.2 芽孢桿菌分離純化

將1.2.1得到的勻漿液置于促芽孢培養基中，37 ℃培養24 h。培養結束后置于80 ℃水浴30 min 以除去非芽孢菌，后續將培養液進行連續稀釋（10-1至10-6）并涂布在NB平板上，在好氧條件下于37 ℃培養24 h。培養結束隨機挑出一個菌落重新劃線于新的NB 平板上，重復3 次以獲得純培養物。將純化的菌株保存在含有15%無菌甘油的NB 肉湯中，并保存在-80 ℃待用。

1.2.3 抑菌能力測定

參考沙玉杰[12]的報道使用瓊脂擴散法測試乳酸菌的抑菌活性，乳酸菌以0.1 OD的接種量接種到MRS培養基中，30 ℃搖瓶發酵48 h 后，4 ℃，5000 r/min離心5 min 得到上清發酵液。副溶血弧菌ATCC17802在TSB 培養基中37 ℃培養24 h 后，根據麥氏比濁管將活菌數調整為1×106cfu 并接種到TSB 平板中，靜置20 min 后得到實驗平板。在實驗平板上均勻地放下4 個牛津杯，向其中兩個分別加入200 μL 發酵上清液，一個加入200 μL 1 mg/mL 抗生素多粘菌素類B 作為陽性對照，一個加入200 μL MRS 培養基作為空白對照。28 ℃培養24 h 后觀察抑菌圈的大小。益生菌的相對抑菌活力I（實驗組相對于抗生素的抑菌效率，%）用以下公式表示：

式中：H1為實驗組抑菌圈直徑；C1為陽性對照抑菌圈直徑。

1.2.4 菌株粘附性實驗

將100 μL 蝦腸道粗粘液分別添加至96 孔板中，4 ℃過夜固定，用250 μL 無菌PBS 溶液沖洗96 孔板2 次以除去未固定的粘液。所有候選乳酸菌用MRS 培養基調整OD 為1.0，取50 μL 菌液加入到96 孔板中，37 ℃孵育1 h。孵育結束后使用PBS 7.2 清洗掉未固定的菌液，加入200 μL 的無菌PBS 7.2 緩沖液重懸菌體，重懸液進行連續稀釋（10-1至10-2）后，分別取15 μL 稀釋液涂布到MRS 平板上，37 ℃培養24 h。隨選取適當的稀釋度進行菌落計數。原菌液經過適當稀釋后涂布到MRS 平板上作為空白對照。粘附率A 粘附計算公式如下：

式中：N1為實驗組菌落數量；N2為對組照菌落數量；n1為實驗組的稀釋倍數；n2為對照組的稀釋倍數。

1.2.5 菌株產水解酶能力鑒定

借鑒陳小敏[13]所報道的方法對候選菌株產酶能力進行測定，將前面分離的菌株分別點種于淀粉酶篩選培養基、蛋白酶篩選培養基、木聚糖酶篩選培養基、甘露聚糖酶篩選培養基中，平板放置于37 ℃下培育48 h，培養后的具體操作如下：

（1）淀粉酶生產菌篩選：往篩選平板中滴加適量碘液；

（2）蛋白酶生產菌篩選：往篩選平板上加入少量10%三氯乙酸溶液，靜置15 min 后倒去；

（3）木聚糖酶生產菌篩選：往篩選平板中加入適量剛果紅染液，靜置30 min，讓其充分染色，先用蒸餾水沖洗，再用1 mol/L 的氯化鈉水溶液沖洗染液；

（4）觀察并記錄菌落（C）和透明圈直徑（H）算出H/C 值，判斷其產水解酶能力。

1.2.6 生理生化鑒定及16S rDNA 鑒定

根據相關的實驗結果，選取6-24 與B9 送至美吉生物有限公司進行16S rDNA 全序列測試，其測序結果提交至NCBI 進行序列比對。此外根據《常見細菌系統鑒定手冊》對6-24 和B9 進行生理生化鑒定。

1.3 養殖試驗

1.3.1 菌株處理

堅忍腸球菌（E.durans）6-24 和枯草芽孢桿菌（B.subtilis）B9分別在MRS培養基中30 ℃靜置培養24 h，接種量為1 OD，培養后5000 r/min 離心10 min，無菌生理鹽水洗滌3 次后備用。

1.3.2 發酵飼料制備

發酵飼料制備根據袁春營等[14]的方法稍稍修改。將濃度均為2×109cfu/mL 的堅忍腸球菌6-24、堅忍腸球菌B9 菌按體積比1:1 混合，向混合菌液中加入2 g/L的紅糖后按照體積比1:80 加入自來水，混合均勻，與商業飼料（通威股份有限公司，南美白對蝦1 號料），按照2:5 的比例攪拌均勻，塑料薄膜密封發酵24 h，制成實驗飼料。此時發酵前飼料中各菌的濃度均為1×107cfu/kg。

1.3.3 飼養管理

本研究設置1 個實驗組T 和1 個對照組C，每個組設置三個水族箱作為平行實驗。水族箱規格600 mm×500 mm×450 mm，每個水族箱中投放20 只羅氏沼蝦。

飼養期間，T 組投喂發酵飼料，C 組投喂普通的商業飼料，投餌量為對蝦體質量的1%～3%進行投喂，每天投喂2 次，投喂時間為8:00 和16:00，飼養時間為4 周。飼養期間記錄每天飼料攝入量，水溫27～29 ℃，pH 7.5～8，期間連續通氧。

1.3.4 羅氏沼蝦免疫參數分析

養殖期結束后，每個水族箱取5 只蝦并根據Ranjit等[15]的方法進行血淋巴的抽取。對于總血球計數（total haemocyte count，THC），將血淋巴按照體積比1:9 放在福爾馬林溶液中稀釋，然后取20 μL 溶液放在血球計數板上，使用復合顯微鏡測量總血球數量。通過以下公式計算總血細胞計數：

式中：N為中央大方格血細胞的數量；n為稀釋倍數；10000為1 mL 里的THC。

對于酚氧化酶（phenoloxidase，PO）活力的測定，將血淋巴與TBS 溶液按體積比1:9 混合，將50 μL 混合液置于96 孔板中，加入50 μL 1 mg/L 的胰蛋白酶（trypsin）孵育5 min 后，添加50 μL 3 mg/mL 的L-DOPA 到每個孔中，同時添加100 μL TBS 溶液作為空白對照。孵育5 min 后，在492 nm 處測量形成的多巴色素。PO 活性通過以下公式計算：

式中：Ipo為酚氧化酶活性；|A2-A1|為每分鐘在492 nm 處的吸光度變化；0.001 代表每分鐘使492 nm 處吸光度上升0.001為一個活性單位；Ew為測試混合物中所含血淋巴的體積（mL）。

對于超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）以及溶菌酶（lysozyme，LZM）活力的測定，參照“1.1.2實驗材料與試劑”中的酶試劑盒說明書進行測定。

1.3.5 腸道消化酶測定

每個實驗組中取0.1 g 腸道組織，用1 mL 0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）勻漿并以12,000 r/min離心5 min 以獲得酶粗提液。

淀粉酶活力參考Xiao[16]等的方法進行測定，以1 mg 蛋白每分鐘水解淀粉產生1 mg 葡萄糖為1 個酶活力單位（U）。蛋白酶參考Zhang 和Zhang[17]的方法進行測定，以1 mg 蛋白每分鐘水解干酪素產生1 μg 酪氨酸為1 個酶活力單位（U）。脂肪酶根據Aryee[18]等方法進行測定。以1 mg 蛋白每分鐘使OD 值每上升0.001 為1 個酶活力單位（U）。

1.3.6 羅氏沼蝦腸道弧菌的計數

在無菌條件下提取0.1 g 的腸道組織，將其浸泡在2 mL 預冷的0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）中，4 ℃放置24 h 后勻漿。勻漿液進行10-1至10-6的梯度稀釋后分別涂布在TCBS 平板上，37 ℃培養24 h 后選取適當的稀釋度進行計數。

1.4 數據統計與分析

每個實驗設置3 個平行。各喂養組數據使用單因素方差（One-Way ANOVA）分析，若處理有顯著差異則進行多重比較（Tukey"s）檢驗。分析軟件為Excel 2016，實驗數據均以“平均值±標準差（Mean±SD）”表示。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌抑菌與粘附能力對比

抑菌效果是水產養殖中益生菌篩選的重要指標之一[19]。本研究根據1.2.1 的方法在MRS 培養基中一共分離得到26 株形態、大小不一樣的乳酸菌并考察了其抗菌能力。該研究以對大多數致病菌有抑制作用的多粘菌素類B 為對照，將乳酸菌抑菌圈與多粘菌素類B（1 mg/mL）產生的抑菌圈作對比，發現其中12 株對副溶血弧菌ATCC17802 具有抑菌活性（圖1），相對抑菌率在40%到70%之間。相對抑菌率40%，可以理解為該菌對副溶血弧菌ATCC17802 的抑菌能力相當于0.4 mg/mL 多粘菌素類B。12 株菌中，4-12、4-1以及6-24 相對抑菌率超過60%，6-24 的相對抑菌活力最高，達到68.94%。上述實驗結果顯示，自羅氏沼蝦腸道內分離的乳酸菌對副溶血弧菌有較好的抑制能力。沙玉杰[12]的研究也發現，飼喂乳酸菌時凡納濱對蝦的副溶血弧菌感染率下降86.86%，這與本實驗結果得以互相印證。Sha 等[20]的研究指出，使用NaOH 溶液將乳酸菌發酵上清液中和到pH 7.0 后，失去了對副溶血弧菌ATCC17802 的抑菌活性，推測有機酸質的產生可能是乳酸菌發揮抑制病原菌生長繁殖的重要原因之一。

圖1 各乳酸菌株對副溶血弧菌ATCC17082 的相對抑菌率Fig.1 Relative antibacterial activity of LAB to V. parahaemolyticus ATCC 17802

腸道粘液能夠為生物體提供所需營養的同時也是各種微生物粘附腸道的橋梁[21]。益生菌能夠與病原菌競爭粘附位點，從而抑制病原菌的生長與繁殖，因此對腸道粘附能力的強弱也成為了益生菌篩選的標準之一。Sugimura 等[22]曾使用平板計數法來評價菌株對腸道粘液的粘附性能，并篩選出了一株相對粘附率為20.15%的棉籽糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）。本實驗結果表明，第一輪篩選獲得的26 株乳酸菌菌株均具有粘附能力，如表2～6 所示。26 株乳酸菌菌株中，14 株菌株粘附能力超過10%，2 株菌株粘附能力超過20%。令人欣喜的是，6-24 表現出最高的粘附能力，黏附能力達到21.55%，與其優越的抑菌活性十分匹配。因此，后續對6-24 開展了進一步鑒定，并研究用其飼喂羅氏沼蝦后，蝦體的免疫能力變化情況。

表1 乳酸菌粘附能力排名（黏附活性從高到低排列）Table 1 The adhesive activity of LAB

2.2 芽孢桿菌水解酶能力對比

目前研究報道認為，淀粉酶和木聚糖酶能夠分解水產動物腸道中的碳水化合物，為機體的生長發育提供能量，蛋白酶則能夠水解各種蛋白質和多肽，為機體提供各種氨基酸，因而高產淀粉酶，蛋白酶等多種水解酶的芽孢桿菌可以考慮作為益生菌開發。

表2 候選芽孢桿菌菌株水解酶產酶情況Table 2 Hydrolytic enzyme-producing ability of Bacillus

本研究根據1.2.2的方法從NB培養基中分離得到12 株形態、大小不一的芽孢桿菌，采用平板透明圈觀察法，對的產淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶能力進行了評價。表2 顯示，自羅氏沼蝦腸道中分離出來的12株內源芽孢桿菌大多具備水解酶產酶能力，僅有1 株不生產淀粉酶、木聚糖酶和蛋白酶中的任何一種。而產一種酶的有4 株，產兩種水解酶的有6 株。在12株芽孢桿菌中，B9 表現優秀，被檢測出能夠產3 種酶，且三種酶的產酶能力均較其他株表現良好，因此選取B9，合并乳酸菌6-24，一同研究他們作為內源益生菌的免疫和腸道改善能力。

2.3 候選菌株的鑒定

基于6-24 和B9 的優越性能，本研究對這兩株菌進行了分子生物學和生理生化鑒定。16S rDNA 鑒定顯示，6-24 和B9 分別相似與Enterococcus duransHCD35-4 和Bacillus subtilisJCM1465，相似度均為99.99%，系統發育進化樹分析進一步證實了兩株菌與其相近株的同源性，如圖2 所示。進一步結合《常見細菌系統鑒定手冊》對這兩株菌進行了生理生化鑒定，如表3 所示。鑒定結果表明這兩株菌分別為堅忍腸球菌和枯草芽孢桿菌，因此本研究將兩株菌命名為E.durans6-24 和B.subtilisB9。

圖2 基于16S rDNA 進化樹發育分析Fig.2 Phylogenetic relationship based on 16S rDNA

表3 各菌株生理生化檢測結果Table 3 Physiological and biochemical test results of each strain

2.4 飼料中添加6-24、B9 對羅氏沼蝦非特異性免疫能力的影響

羅氏沼蝦作為無脊椎動物，機體自身并不具有特異性免疫，因此先天性免疫系統成為了其對抗病毒以及病菌的重要屏障。蝦的先天性免疫應答主要由總血球細胞，酚氧化酶原系統（proPO），抗氧化系統以及溶菌酶四個部分組成。

酚氧化酶（PO）是酚氧化酶原系統所表達的重要蛋白，能將酚類物質轉化為醌類物質來阻止微生物對機體的感染。Ranjit 等[15]在飼料里添加不同濃度的枯草芽孢桿菌后，羅氏沼蝦血淋巴中PO 活性隨著菌株濃度的上升而提高，上升幅度最大達到46.40%。在本研究中，圖3a 顯示實驗組PO 活性上升48.24%（p＜0.05），該結果表明6-24 與B9 聯用，能夠有效促使PO 活性提高。Sudarat 等[23]研究指出，向南美白對蝦喂養乳酸菌后，PO 活性和與相關免疫基金LvproPO的mRNA 表達量都有顯著的上升，說明益生菌可以通過對酚氧化酶原系統的激活來調節酚氧化酶的活力，參與到對蝦機體免疫防御。

蝦的天然免疫中，病原微生物被免疫細胞吞噬的過程會通過NADPH 氧化酶產生大量的活性氧（ROS），而大量的活性氧會對機體造成傷害，因此超氧化物歧化酶（SOD）可以中和過量的活性氧以維持機體的平衡。在本研究中，實驗組組SOD 活性上升4.42%（p＜0.05）（見圖3b），這一結果與汪波[10]的研究結果一致，反映了6-24 與B9 能促進蝦體SOD 的表達，進而有助于清除蝦體內的自由基，使蝦體保持正常的免疫狀態。

圖3 發酵飼料對羅氏沼蝦非特異性免疫能力的影響Fig.3 Effects of fermented feed on immune parameters of M.rosenbergii

在大多數甲殼類動物中，溶菌酶（LZM）是一類在血淋巴或血細胞中表達的具有抗菌活性的蛋白質[24,25]，它是甲殼類動物先天性免疫的重要組成部分。Dong 等[26]研究指出蝦在細菌的干預下LZM 的表達情況會有所改變。圖3c 顯示實驗組LZM 活力與對照組相比上升198.00%（p＜0.05），說明LZM 可被B9 以及6-24 所誘導表達。除此之外，總血球細胞數量（THC）的提高也是LZM 活力上升的重要原因，總血球細胞在先天性免疫系統中不僅負責吞噬，包囊以及結節形成，同時也是某些免疫蛋白質的來源[27]。Daruosh 等[28]研究指出對南美白對蝦喂養枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus lichenformis）后THC 上升了12.15%，同時LZM 活力上升88.34%。圖3d 顯示實驗組的THC 在喂養了B9 和6-24 后相對于C 組上升了96.54%（p＜0.05），跟上述結果一致，說明LZM 活性與總血球細胞數量之前存在著相關性。

2.5 飼料中添加6-24、B9 對羅氏沼蝦腸道消化酶活力的影響

圖4 發酵飼料喂養對羅氏沼蝦腸道環境的影響Fig.4 Effect of fermented feed on intestinal environment of M.rosenbergii

水生動物的生長取決于消化道中各種營養物質的消化、吸收和轉化，這些復雜而多樣的過程是通過腸道中的消化酶進行的。Ye 等[29]發現飼料中添加益生菌后蛋白酶活力和淀粉酶活力都有增加，但蛋白酶活力上升87.53%，較其他水解酶活力增強很多。圖4 所示，實驗組羅氏沼蝦腸道中淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活力確實比未添加混合益生菌的對照組有顯著提高（p＜0.05），多項研究報告也證實混合益生菌的添加顯著提高了蝦腸道消化酶的活力[30,31]。與Ye 的研究結果一致性非常好的是，經飼喂益生菌后，羅氏沼蝦體內的蛋白酶活力提升了84.80%。推測枯草芽孢菌B9 在落實沼蝦腸道內能夠進行順利定植，并產生大量蛋白酶，從而良好地促進了各種蛋白質和多肽的水解，為機體提供各種氨基酸養料，這一結果有待進一步后續驗證。

2.6 飼料中添加6-24、B9 對羅氏沼蝦腸道可培養弧菌的影響

哈氏弧菌、副溶血弧菌以及溶藻弧菌等弧菌屬細菌一直是導致蝦發病的主要病原體，它們所引起的疾病是世界各地養殖魚，貝類，蝦等中的主要流行病，也是水產養殖中危害最大的細菌性疾病。因此，蝦腸中弧菌的數量是蝦體是否健康的重要指標之一。

4 周后各組腸道中可培養弧菌數量如圖5 所示，T組腸道中的可培養弧菌數量相對于C 組下降了59.76%（p＜0.05），張盛靜等[9]的研究中發現使用含有地衣芽孢桿菌的飼料28 d 后，腸道中LZM 基因表達顯著上調，腸道中可培養弧菌數量相對于對照組只下降4.64%，與本研究結果不完全一致，推測存在以下兩種原因，第一，高粘附性的6-24 通過粘附位點的競爭以及分泌有機酸，抑制了弧菌的生長。第二，在喂養了6-24 和B9 后使血淋巴中溶菌酶的表達量上升，溶菌酶能夠使弧菌死亡從而導致腸道內弧菌數量有所減少。

圖5 各處理組腸道中可培養弧菌數量圖Fig.5 Culturable Vibrio in the intestine of each treatment group

3 結論

本研究從抑菌試驗、粘附性實驗和特定水解酶產酶活力三方面考量，成功地從羅氏沼蝦的腸道篩選出兩株內源益生菌，一株是具有高抑菌能力以及高粘附能力的堅忍腸球菌6-24，另外一株是具有較好產酶能力的枯草芽孢桿菌B9。將兩株菌株按1:1 比例復合添加到飼料中制備發酵飼料，初步分析知道內源性的堅忍腸球菌6-24 和枯草芽孢桿菌B9 能夠有效增強羅氏沼蝦的非特異性免疫能力，以及強化其腸道消化酶酶活力。據了解，這也是第一次將堅忍腸球菌作為益生菌對羅氏沼蝦進行干預以及開展其對蝦的益生功能評價。本研究結果顯示，添加濃度為1×107cfu/kg 的堅忍腸球菌6-24 與枯草芽孢桿菌B9 于飼料中，不僅可以有效提高羅氏沼蝦的免疫能力，同時可以改善其腸道環境，降低腸道弧菌的數量，具有進一步開出蝦飼用益生菌的潛在可能。