SCH23390 對嗎啡戒斷反應和突觸素的影響

唐 珊 周圣荃 劉巧鳳

成都醫學院病理與病理生理學教研室，四川成都 710083

突觸素（synaptophysin，SYN）是包裹突觸小泡的膜蛋白，是突觸活性和突觸生長過程中的分子標志物[1]。濫用藥物會對神經元的突觸連接和功能產生影響，遍及大腦的獎賞回路，包括海馬、伏核、腹側被蓋區和中腦導水管灰質區等[2-10]。嗎啡依賴大鼠注射納絡酮誘發戒斷反應后，中腦導水管灰質區、藍斑、黑質、豆狀核、杏仁核神經細胞的突觸在結構上表現為數量增多，并隨嗎啡依賴時間的延長而明顯增加[11]。嗎啡成癮大鼠注射納絡酮引發戒斷反應，海馬突觸密度增加，突觸素表達增加[12-13]。自然戒斷大鼠，伏核突觸密度和數量增加，突觸連接面積增加[14]。前期研究發現多巴胺D1 受體拮抗劑SCH23390 降低嗎啡戒斷反應，但突觸可塑性是否在此過程中起作用，還有待研究。因此，本研究將探討SCH23390 對戒斷反應和突觸素表達的影響，為臨床應用嗎啡減輕副作用提供理論基礎。

1 對象與方法

1.1 主要試劑

多巴胺D1 受體拮抗劑SCH23390（美國Abcam 公司，批號：ab120597）；多巴胺D1 受體激動劑SKF38393（美國Abcam 公司，批號：120740）；兔抗SYN 單克隆抗體（美國Abcam 公司，批號：ab32127）；鼠抗β-actin單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司，批號：sc-47778）；山羊抗鼠或山羊抗兔IgG 二抗（美國Millipore 公司，批號：21538、21537）；鹽酸嗎啡注射液（沈陽第一制藥廠，批號：161015-1）；DAB 染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZLI-9018）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋公司，批號：SAP-9101、SAP-9102）。

1.2 實驗動物和分組

8 周齡Wistar 雄性大鼠，體重200～230 g，飼養溫度（24±1）℃，購自成都達碩實驗動物公司，合格證號SCXK（川）2020-030。實驗方案經成都醫學院動物實驗倫理委員會批準。將40 只大鼠按隨機數字表法分為對照組、嗎啡組、SCH23390 組和SKF38393 組，每組10 只。嗎啡組、SCH23390 組和SKF38393 組大鼠按劑量遞增原則，每日8:00 及20:00 腹腔注射嗎啡1 次、連續5 d，劑量從10 mg/kg（第1 天起）逐漸增至50 mg/kg（第5 天）。SCH23390 組第1～4 天上午注射嗎啡前15 min 中腦導水管灰度區（PAG）核團微量注射0.5 μL 10 mmol/L SCH23390；SKF38393 組PAG 核團微量注射0.5 μL 5 mmol/L SKF38393。對照組腹腔注射等量生理鹽水。所有大鼠第5 天注射鹽水或嗎啡后1 h 腹腔注射納洛酮（4 mg/kg），觀察戒斷反應[15-16]。

1.3 戒斷反應

記錄30 min 內可數癥狀（如僵直、跳躍、濕狗抖動、摩擦身體、跑或反常姿勢）次數，每個癥狀每出現1 次記1 分。不可數癥狀（如齒顫、瞇眼、腹瀉、呵欠、陰莖勃起、眼淚或鼻涕），每5 分鐘記錄1 次，每個癥狀每出現1 次記1 分，最高為6 分。體重減少率=（納絡酮注射前體重-注射后1 h 體重）/注射前體重×100%，每減少1%記1 分。全部體征評分總和為該只動物戒斷反應總分[17-18]。至實驗結束，無動物死亡。

1.4 PAG 埋管

大鼠異氟烷吸入麻醉后固定在立體腦定位儀上，將外徑0.6 mm 的不銹鋼雙套管埋入PAG（AP：-7.6 mm，ML：±0.70 mm，DV：-5.0 mm）[19]，注射針外徑0.4 mm超出套管下端1 mm，用牙科水泥固定。

1.5 Western blot 檢測

將PAG 核團加入含PMSF、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 蛋白裂解液，研磨離心收集上清液。按照Bradford 方法測量蛋白濃度[20]。然后進行SDSPAGE 電泳、轉膜和封閉。孵育SYN 抗體（1∶300）或β-actin 抗體（1:1000）4℃過夜。次日加二抗孵育。使用Quantity One 軟件對結果進行分析。

1.6 免疫組化和陽性細胞計數

常規脫蠟復水，微波抗原修復，山羊血清封閉，滴加1∶100 SYN 抗體4℃過夜。次日孵育二抗37℃20 min，滴加辣根酶復合物37℃15 min，DAB 顯色，蘇木精復染，常規脫水透明封片。在光學顯微鏡下，SYN 陽性細胞為圓形或梭形，細胞漿呈棕褐色。每張切片40 倍鏡下取PAG 背側、左上、右上、左下和右下5 個鏡野，計數每個鏡野陽性細胞總數，取均值。

1.7 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析結合Bonferroni 檢驗，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組大鼠戒斷反應行為學比較

嗎啡組戒斷反應總分及齒顫、腹瀉、反常姿勢、瞇眼、濕狗樣抖動評分高于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。SCH23390 組戒斷反應總分、齒顫、腹瀉評分低于嗎啡組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。SKF38393 組和嗎啡組戒斷反應總分及齒顫、腹瀉、瞇眼、濕狗樣抖動評分比較，差異無統計意義（P ＞0.05）；而SKF38393 組反常姿勢評分高于嗎啡組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 四組大鼠戒斷反應行為學比較（分，，n=10）

表1 四組大鼠戒斷反應行為學比較（分，，n=10）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與嗎啡組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

2.2 四組大鼠SYN 蛋白和陽性神經元數量比較

嗎啡組SYN 蛋白表達水平高于對照組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。SCH23390 組SYN 蛋白表達水平低于嗎啡組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。SKF38393 組SYN 蛋白表達水平高于嗎啡組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖1、表2。

嗎啡組SYN 陽性神經元數量高于對照組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。SCH23390 組SYN 陽性神經元數量低于嗎啡組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。SKF38393 組SYN 陽性神經元數量高于嗎啡組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2、圖2。

圖1 Western blot 檢測SYN 蛋白表達情況

表2 四組大鼠SYN 蛋白和陽性神經元數量比較（，n=5）

表2 四組大鼠SYN 蛋白和陽性神經元數量比較（，n=5）

注：與對照組比較，**P ＜0.01；與嗎啡組比較，#P ＜0.05。SYN：突觸素

3 討論

嗎啡暴露大鼠預先給予SCH23390 治療后，會降低戒斷反應和SYN 表達，相反，多巴胺D1 受體激動劑增加了反常姿勢和SYN 表達。體外實驗發現，缺失多巴胺D1 受體的細胞培養液，將減少樹突棘和SYN表達；反之，增加多巴胺D1 受體的細胞培養液將增加樹突棘和SYN 表達[21]。多巴胺D1 受體拮抗劑SCH23390 逆轉長期使用成癮物質引起的突觸數量和突觸后密度長度增加，并減少突觸蛋白的表達[22-23]。多巴胺D1 受體激動劑SKF38393 干預后，在一定程度上減輕神經元超微結構的損壞程度，使突觸囊泡較多，突觸后致密帶增厚[24]。在神經系統疾病中多巴胺D1 受體拮抗劑SCH23390 增加神經元樹突棘消亡率[25]。

圖2 免疫組化檢測SYN 陽性神經元定位和表達（DAB 染色，400×）

綜上所述，SCH23390 可能通過降低SYN 抑制嗎啡戒斷反應，以上發現將為臨床應用嗎啡減輕副作用提供理論依據。