免疫抑制法檢測肌酸激酶同工酶MB臨床應用評價*

陳聞達，李懿皞，朱晶，邵文琦，王蓓麗，2，郭瑋，2

(1.復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海200032；2.復旦大學附屬中山醫院廈門醫院檢驗科，福建廈門361015)

流行病學調查指出，在未來一段時間內，心血管疾病仍將是城鄉居民最主要死亡原因之一[1]。肌酸激酶(creatine kinase, CK)和CK同工酶MB(creatine kinase isozyme MB, CK-MB)是經典的心肌標志物，在急性心肌梗死等急性冠脈綜合征的診斷及心肌手術的術后監測上有著較為廣泛和成熟的應用[2]。免疫抑制法是當下CK-MB臨床檢測中應用較為廣泛的方法，由于常規試劑盒中僅加入抗人CK-M亞基單克隆抗體，在常規臨床檢測中可能會出現CK-MB含量大于CK的情況，即CK與CK-MB結果倒置現象(簡稱“CK結果倒置”)。為了改善這一情況，有部分廠商也選擇在試劑盒中添加抗人線粒體型CK(mitochondrial creatine kinase, MtCK)單克隆抗體，但目前尚無驗證這類試劑盒性能的報道。因此，本研究選擇了一款添加了抗人MtCK單克隆抗體的免疫抑制法CK-MB檢測試劑盒進行性能驗證，同時對收集的CK結果倒置的標本進行回顧性分析。

1 對象和方法

1.1研究對象

1.1.1健康人對照組 選擇2020年8月至9月在復旦大學附屬中山醫院體檢中心體檢的表觀健康人50例作為健康人對照組。經影像、超聲及體格檢查排除高血壓、冠心病、糖尿病、腫瘤等疾病，肝腎功能正常且免疫學檢查無腫瘤標志物升高。所有標本無明顯的溶血、脂血及黃疸。

1.1.2心血管疾病組 選擇2020年8月至9月就診于復旦大學附屬中山醫院、確診為心血管疾病并進行CK、CK-MB檢測的50例患者作為心血管疾病組。所有患者均已簽署知情同意書。此外，收集2020年8月至10月就診于復旦大學附屬中山醫院進行CK、CK-MB檢測并報告“CK濃度小于CK-MB濃度”的28例患者。

1.2主要儀器與試劑 日立公司7600-030型全自動生化分析儀及世諾公司CK-MB測定試劑盒用于驗證，羅氏公司cobas c702全自動生化分析儀及配套的CK-MB檢測試劑盒、CK檢測試劑盒用于對照；CK同工酶電泳采用法國Sebia公司的HYDRASYS電泳儀及專用的CK同工酶電泳試劑盒。

1.3標本采集與處理 用BD含惰性分離膠促凝劑的真空血清采血管采集靜脈血標本，室溫靜置30 min后，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min分離血清，分裝后凍存于-80 ℃。

1.4方法學性能驗證

1.4.1正確度驗證 選擇與校準不同批號的校準品(1水平)及2020年全國心肌標志物室間質評物202021、202022、202023、202024、202025(2至6水平)分別重復檢測3次，計算均值及相對偏倚，觀察相對偏倚是否在廠商聲明的可接受范圍(15%)內。

1.4.2精密度驗證 選擇高、中、低3個水平的定值質控品，每日分別檢測5次，連續檢測5 d，計算其不精密度，觀察其不精密度是否在廠商聲明的可接受范圍(7%)內。

1.4.3線性范圍驗證 選取已知CK-MB活性的高值和低值標本，按不同比例稀釋，配制成5個不同濃度的混合血清，每個濃度分別檢測3次，計算其均值作為實測值。根據CNAS-GL037要求進行多項回歸分析，并對非線性系數作t檢驗，判斷非線性系數與0差異是否有統計學意義，如無差異則表示回歸方程為一階線性。

1.4.4最大稀釋比驗證 選取已知CK-MB活性的高值標本1例，梯度稀釋至試劑盒聲明的最大稀釋倍數，得到5個不同濃度的稀釋標本。每個稀釋標本分別檢測3次，計算其均值及相對偏倚，觀察其相對偏倚是否在廠商聲明的可接受范圍(10%)內。

1.4.5參考區間驗證 選擇2020年8月至9月在復旦大學附屬中山醫院體檢中心體檢的健康人50例作為參考區間驗證組。年齡18～65周歲，男女比例為1∶1。經影像、超聲及體格檢查排除高血壓、冠心病、糖尿病、腫瘤等疾病，肝腎功能正常且免疫學檢查無腫瘤標志物的升高。所有標本無明顯的溶血、脂血及黃疸。觀察所有數據的第95百分位數是否位于廠商聲明的參考區間(≤12 IU/L)內。

1.5臨床應用評價 健康人對照組和心血管疾病組標本分別用世諾公司CK-MB測定試劑盒進行檢測，并評價對比試劑盒在心血管疾病患者中的應用與診斷效能。

選取臨床報告“CK濃度小于CK-MB濃度”，即CK結果倒置的患者血清標本28份，分別先用世諾公司CK-MB測定試劑盒進行檢測，對比其檢測結果與羅氏公司CK-MB檢測試劑盒的結果，觀察患者CK結果倒置情況是否被糾正。隨后，用Sebia公司CK同工酶電泳試劑盒對上述標本血清進行檢測及驗證。

2 結果

2.1正確度驗證 1水平的定值校準品的重復檢測均值為91 IU/L，與定值(90 IU/L)間的偏倚為1.11%，小于廠商聲明的可接受范圍(15%)。室間質評物202021、202022、202023、202024、202025重復檢測的均值分別為13、84、159、50、127 IU/L，與各自靶值(12.44、82.03、165.33、49.13、120.05 IU/L)的相對偏倚分別為4.5%、2.4%、-3.8%、1.8%、5.8%，均位于室間質評報告提供的允許范圍內。

2.3線性范圍驗證 二階方程非線性系數b2及三階方程非線性系數b2、b3均與0差異無統計學意義，表明在1.6～1 050 IU/L范圍內，試劑盒線性良好，符合廠商聲明的線性范圍。

2.4最大稀釋比驗證 選取已知CK-MB活性的標本(1 046.7 IU/L)，經1∶2、1∶4、1∶8和1∶10稀釋后分別進行檢測，所得結果與理論值之間的相對偏倚分別為0%、0.9%、3.1%、6.5%和8.9%。所得結果的相對偏倚均小于廠商要求的相對偏倚(10%)，表明試劑盒滿足廠商聲明的最大稀釋比(1∶10稀釋)的性能要求。

2.5參考區間驗證 50例樣本結果分布于2～10 IU/L內，第95百分位數值為9 IU/L，滿足廠商聲明的參考區間。

2.6臨床應用評價

2.6.1對心血管疾病的檢測效能 健康人對照組年齡為(47.1±10.2)歲，男性36名，占72%；病例組年齡為(57.6±18.1)歲，男性36名，占72%。兩組患者世諾公司CK-MB測定試劑盒的檢測結果分別為(5.88±1.35) IU/L和(135.42±93.21) IU/L，差異有統計學意義(t=-9.826，P<0.01)。

2.6.2對CK結果倒置的校正情況 28例臨床報告為CK結果倒置的患者中,有10例經世諾公司CK-MB測定試劑盒檢測后，結果得到校正，CK同工酶電泳結果也顯示患者存在明顯的巨CK-Ⅱ(主要組成為線粒體CK)條帶。但該10例中有2例患者CK倒置結果僅得到部分校正，糾正后CK結果仍然倒置但程度減輕。經CK同工酶電泳結果顯示，患者體內除巨CK-Ⅱ外，還存在CK-BB(見圖1A)；剩余18例的CK倒置結果未得到校正，CK同工酶電泳結果顯示，患者存在明顯的巨CK-Ⅰ條帶(見圖1B)，說明患者的CK結果倒置情況主要由巨CK-Ⅰ導致。表明采用添加了MtCK抑制劑的CK-MB檢測試劑盒能較好地糾正由于MtCK的存在引起的CK倒置情況，而由巨CK-Ⅰ等其他亞型的CK同工酶存在引起的CK結果倒置，則可能仍需通過CK同工酶電泳的方式進行辨認。

注：A,得到部分糾正的CK倒置患者CK同工酶電泳結果，結果顯示患者除存在明顯的巨CK-Ⅱ(線粒體型CK)條帶；B,未得到糾正的CK倒置患者CK同工酶電泳結果，結果顯示患者存在明顯的巨CK-Ⅰ條帶。橫坐標為相對位置，峰的高度表示對應位置的吸光度大小。

3 討論

目前試劑盒中常采用免疫抑制法檢測CK-MB活性。臨床實踐表明，這一檢測方法常能得到CK-MB活性高于總CK活性即CK結果倒置的情況[3-5]。這類患者常需通過額外的CK-MB質量法或CK同工酶電泳檢測來得到可靠的結果。臨床研究表明，引起CK結果倒置很大一部分的原因在于巨CK、MtCK等異常CK同工酶的存在[4-6]。因此，增加這類CK同工酶的抑制性抗體以使CK-MB活性檢測更加準確至關重要。

MtCK是存在于細胞線粒體內膜、外膜間隙中的CK同工酶家族成員，其與CK-BB、CK-MM和CK-MB等一同在組織細胞能量代謝過程中扮演重要角色。MtCK可分為廣泛型(ubiquitous MtCK，uMtCK)和肌節型(sarcomeric MtCK)2種不同亞型，前者廣泛表達于肝臟、腦、腎臟等組織器官中，而后者僅見于橫紋肌[7]。在炎癥性疾病或腫瘤疾病中，由于大量的組織損傷及后續細胞凋亡過程的發生，MtCK被釋放入血。目前常規試劑盒采用免疫抑制法檢測的原理，添加的抑制性抗體無法抑制血液中多余的MtCK的活性，所以MtCK常能引起這類患者CK-MB活性假性增高。近年來，也有許多研究發現了MtCK與肝炎、結直腸癌、肝癌等疾病的相關性[7-10]。

本研究選擇添加MtCK抑制性抗體的CK-MB檢測試劑盒進行相關的性能驗證及臨床應用評價。在臨床應用方面，添加了MtCK抑制抗體的試劑盒對臨床心血管疾病的輔助診斷無明顯影響。而對CK倒置患者標本的檢測結果表明，運用添加了MtCK抑制抗體的試劑盒能較好地糾正由于巨CK-Ⅱ存在導致的CK結果倒置，從而能更好地為臨床提供參考，其結果也得到了CK同工酶電泳的驗證。由于巨CK-Ⅰ、過多的CK-BB等其他CK同工酶亞型存在而導致的CK倒置情況可能仍需CK同工酶電泳來進行確認。然而電泳方法對于臨床工作來說速度較慢，操作較為不便，對操作人員的要求也較高。此外，臨床對CK的來源也相當需要關注，尤其需要防止心源性CK-MB升高的誤診和漏診。因此，需要一些更加快速簡便的方法對CK結果倒置的原因進行分辨。王愛華等[11]利用多種方法對巨CK、CK及其亞型進行分辨，其中熱失活方法可使CK-BB、CK-MB快速失活，適用于分辨CK-BB型的CK結果倒置，而CK-MB型可通過其他方法，如單克隆抗CK-MB抗體法直接檢測。熱失活法結合目前成熟的商業化CK和CK同工酶試劑，可以較快地對CK亞型進行分辨，但對于巨CK的快速分型，目前技術條件仍不成熟。