不同家系凡納濱對蝦對低鹽度的適應能力及其適應機理

胡利華 施 巍 劉廣緒 付萬冬 廖妙飛 黃賢克羅 奎 吳佳燕 閆茂倉

(1.浙江省海洋水產養殖研究所, 浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室, 溫州市海洋生物遺傳育種重點實驗室,溫州 325005; 2.浙江大學動物科學學院, 杭州 310058; 3.浙江省海洋開發研究院, 舟山 316021)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei), 又稱南美白對蝦, 廣泛分布于太平洋沿岸水域, 具有生長快、適應力強和出肉率高等特點, 是世界上最重要的水產養殖品種之一[1,2]。自20世紀80年代末成功引入我國以來, 凡納濱對蝦養殖迅猛發展, 已成為我國對蝦的主要養殖品種之一, 據統計目前我國凡納濱對蝦產量已占全世界總產量的約40%[3]。由于凡納濱對蝦對鹽度的適應范圍較廣, 且眾多養殖者認為低鹽度養殖可以有效控制蝦病的暴發, 因而生產實踐中越來越多地采用低鹽乃至淡水養殖凡納濱對蝦[4]。調查結果顯示, 目前浙江低鹽及淡水養殖凡納濱對蝦的產量甚至已超過其海水養殖產量[5]。在此情況下, 養殖水體鹽度對凡納濱對蝦生長和存活的影響在近年來越來越受到人們的廣泛關注。但目前關于凡納濱對蝦鹽度適應的研究結果卻存在一定爭議。例如, Laramore等[6]的研究指出30‰為凡納濱對蝦最適生長鹽度, 但Ogle等[7]卻認為其最適生長鹽度為4‰—8‰。造成這一現象的原因可能是由于不同遺傳背景的凡納濱對蝦在對鹽度的適應能力上具有明顯的差異[8]。因此深入探究不同凡納濱對蝦家系對不同鹽度的適應情況及其適應機理, 進而選育適合低鹽和淡水養殖的凡納濱對蝦, 對選育適合低鹽和淡水養殖的南美白對蝦新品系(種)具有重要的實際應用價值和理論指導意義。

研究表明維持正常的生理代謝水平在對蝦適應鹽度變化的過程中發揮著重要作用[9]。在低鹽或高鹽度水體中, 對蝦需要消耗體內儲存的能量以維持機體的離子濃度和滲透壓水平, 因此對蝦的生理代謝或能量供給在低鹽水體中受到抑制, 有可能是其導致生長率及存活率下降的原因[9,10]。鰓是水生甲殼類動物進行滲透壓調節及離子交換的主要器官和重要場所, Na+/K+-ATP酶(Na+/K+-ATPase)位于鰓細胞表面, 是水生甲殼類動物滲透壓調節過程中Na+和K+的跨膜運輸泵[11]。此外, Ca2+是生物生長發育等諸多生命過程中的關鍵信號分子, 在滲透壓調節過程中Ca2+也起著維持機體離子濃度的重要作用[12]。Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase)是一種重要的離子調節酶, 其為機體滲透壓調節過程中Na+和Ca2+的交換提供了動力[13,14]。因此, Ca2+-ATPase和Na+/K+-ATPase活力很可能也決定了對蝦對鹽度變化的適應能力。但到目前為止, 不同對蝦家系間這些離子調節酶活力是否存在差異尚不知曉。此外,根據報道, 在環境脅迫的條件下(如水體鹽度、酸堿度變化和重金屬污染), 海洋生物將更多的機體能量用于應對環境壓力, 減少在生長、免疫和毒物代謝等生理過程中的能量消耗[15,16]。皮質醇激素是水生生物應激反應過程中產生的一種類激素, 急性及慢性應激反應都可以造成其在血漿中濃度的變化, 因此也常被用于衡量包括對蝦在內多種水生生物所受應激強度的重要指標[17,18]。

為了探究不同凡納濱對蝦家系對鹽度變化的適應能力, 本研究比較了30個凡納濱對蝦家系在3個不同鹽度水體(5‰、20‰和30‰)中的生長性能和存活率。由于機體的能量供給為水生甲殼類動物滲透壓調節提供了動力, 本研究對比分析了各鹽度條件下不同家系間生理代謝、ATP含量及ATP合成關鍵酶酶活力的差異, 以期判斷對蝦能量代謝水平是否影響了其對不同鹽度的適應。此外, 本研究檢測了不同家系凡納濱對蝦鰓Na+/K+-ATPase及Ca2+-ATPase酶活水平, 以分析不同家系對蝦離子轉運能力的差異及其與鹽度適應性之間的關系。最后, 本研究以血漿中皮質醇濃度為指標, 對比分析了不同鹽度下不同對蝦家系的機體應激水平, 以探究機體應激與鹽度適應之間的內在關系。本研究獲得的相關結果, 將有助于篩選凡納濱對蝦鹽度適應性生理指標, 并為對蝦養殖產業合理選擇淡化馴養家系奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗在浙江省海洋水產養殖研究所清江基地進行, 海水取自樂清灣海區[鹽度為(18.5±0.6)‰],在蓄水塘二級砂濾后, 經海水濃縮裝置(杭州帕爾水處理科技有限公司)處理后獲得鹽度為(29.9±0.4)‰的濃縮海水。本實驗所用鹽度為5‰和20‰的海水是利用濃縮海水和淡水調配獲得。2016年通過引入厄瓜多爾、美國、泰國、中國等國內外凡納濱對蝦群體, 采用不完全雙列雜交方式組合構建基礎群體, 2017年構建F1育種核心群體, 采用BLUP(Best line unbiased prediction)方法進行遺傳評估, 在控制近交的情況下, 2018年利用人工定向交尾技術, 通過巢式交配設計構建F2家系103個。家系構建與標準化培育參照已報道的方法[19]。在第五、第六腹節左、背、右3個部位注射2—3種不同顏色(紅、橙、藍、綠)組合的熒光染料標記和區分家系。利用SPSS19.0軟件對熒光標記時的103個家系的體重進行方差分析, 挑選30個差異不顯著的家系(P＜0.05)作為實驗材料(編號范圍6002—6050), 體重(1.61±0.68) g, 在室內養殖池(長5 m×寬4 m×高1.5 m)暫養[水溫(29.2±0.5)℃, pH 8.2±0.1, 鹽度30‰]。暫養期間投喂體質量15%的正大牌對蝦配合飼料, 分6:00、14:00和22:00三次投喂, 每天吸污清理殘餌和蝦殼。

1.2 實驗設計

凡納濱對蝦經5d暫養后, 從每個家系中各挑選108尾大小相近的對蝦[體長(5.48±0.38) cm, 體重(2.17±0.38) g]用于本次實驗。本實驗共設置了2個低鹽度實驗組(鹽度為5‰和20‰)和一個對照組(鹽度為30‰)。實驗在室內養殖池中進行(長5 m×寬4 m×高1.5 m), 每個養殖池中放置每個家系對蝦12尾(共計30家系×12尾=360尾), 實驗設置3個平行重復(共9個養殖池), 處理時間持續30d。記錄各家系對蝦的初始體重用于后續生長率的計算。在進行鹽度梯度養殖實驗前, 需要將實驗用蝦進行淡化馴養, 即從原始水體鹽度(30‰)開始, 每天降低5個鹽度, 逐步達到目標鹽度并穩定2d以避免對蝦的應激反應對實驗結果的影響。實驗期間每天分3次投喂體質量15%的正大牌對蝦飼料, 每4天換水100%并清理殘餌、蝦殼和死蝦, 全程不間斷充氣增氧,自然光照。實驗過程中水體理化參數如表1所示。

1.3 生長率和存活率計算

實驗結束前24h停止投喂, 在實驗結束后統計每個實驗組中每個家系對蝦的存活數量, 按下述公式計算對蝦的存活率(Survival rate %), 其中Nt和N0分別為實驗結束和開始時對蝦的數目。

表1 對照組與實驗組的海水理化參數值(均值±標準誤)Tab.1 Seawater chemistry parameters of the control and experiment groups (Mean±SE)

同時, 在實驗結束時從每個池中取各家系對蝦,擦干對蝦體表水分后, 使用電子天平(BSA3202S,賽多利斯)稱量各實驗組中各家系對蝦體重(精確至0.01 g), 隨后按以下公式計算其特定生長率(Specific growth rate,SGR), 式中W2和W1分別為實驗結束與開始時對蝦的濕重,T為本實驗的持續時間(30d)。

為了對30個對蝦家系在不同鹽度條件下的生長情況進行比較, 參考已報道的方法[7], 本研究將每個鹽度梯度下對蝦的特定生長率與存活率相乘, 計算出30個對蝦家系各組評分, 將3種鹽度下各家系評分相加用以比較各家系鹽度適應能力, 據此篩選出鹽度適應能力最強與最弱的各2個家系以進行后續實驗。

1.4 耗氧率和排氨率的測定

從篩選得到的適應性最強與最弱的4個家系中各取對蝦6尾(6個重復)對其進行耗氧率和排氨率的測定。實驗設6個重復組和一個空白對照組, 以2 L廣口瓶為呼吸瓶, 每瓶中放置一尾對蝦(實驗前已禁食24h), 隨后立即用插有進水管和出水管的瓶蓋密封, 實驗持續2h, 實驗溫度為29.1℃。實驗結束時取水樣測定溶解氧與氨氮含量, 將對蝦擦干于電子天平上稱取濕重。根據之前報道的研究方法[20], 分別通過多參數水質分析儀(Multi 3410 SET4, WTW)和次溴酸鈉氧化法對實驗水體中的溶解氧和氨氮濃度進行測定。

1.5 對蝦肌肉ATP含量及丙酮酸激酶酶活測定

適應性最強與最弱的4個家系中各取6尾對蝦,于冰上解剖取對蝦尾部肌肉組織, 每尾取1 g肌肉組織, 小心勻漿后用于ATP含量測定及丙酮酸激酶酶活測定。此外, 解剖對蝦取其鰓組織, 用作后續Ca2+-ATPase及Na+/K+-ATPase酶活測定[13,20]; 從對蝦的圍心腔中取血液用于皮質醇濃度分析[18]。組織勻漿的蛋白濃度使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒(P0006, 碧云天)進行檢測。在本實驗中, 根據ATP含量測定試劑盒(A095-1, 南京建成)說明書所述方法, 利用分光光度計(UV-2100, 上海菁華)測量樣品在636 nm波長處0.5 cm光徑的吸光度值, 按照以下公式計算得到對蝦肌肉組織的ATP濃度(μmol/g prot)。參考之前的方法[20], 使用丙酮酸激酶測定試劑盒(A076-1, 南京建成)檢測對蝦肌肉組織丙酮酸激酶(PK)活力。

1.6 對蝦鰓Ca2+-ATPase及Na+/K+-ATPase酶活測定

對蝦鰓組織小心勻漿后, 使用超微量的Ca2+-ATPase酶測定試劑盒(A070-4, 南京建成)檢測組織樣品的Ca2+-ATPase酶活力[20]。按試劑盒說明書所述方法加樣后, 使用分光光度計(UV-2100, 上海菁華)測量樣品在636 nm波長處0.5 cm光徑的吸光值(OD值), 進而按照以下公式計算得到Ca2+-ATPase酶活值。

使用超微量Na+/K+-ATP酶測定試劑盒(A070-2-2, 南京建成)對鰓組織的Na+/K+-ATPase活力進行測定[13]。按試劑盒要求加樣后靜置5min, 測量樣品在636 nm波長處1 cm光徑的吸光值。將每小時每毫克細胞蛋白ATP 酶分解 ATP 產生1 μmol無機磷的量定義為一個 ATP 酶活力單位, 即μmol磷/(mg protein·h)(UATPase), 按以下公式計算得到Na+/K+-ATPase酶活力。

1.7 對蝦血漿皮質醇含量測定

對蝦血漿皮質醇含量使用皮質醇ELISA檢測試劑盒(ml024863, 上海酶聯)進行測定[18]。在實驗中使用含有0.5 mL預冷抗凝劑的1 mL預冷注射器, 從對蝦的圍心腔中采血。取得血液后, 將血淋巴離心10min(4℃, 1000 r/min), 取上清即無細胞血漿用以測定皮質醇含量。按試劑盒所述步驟在96孔板內加樣完成后, 使用酶標儀(Multiskan GO, Thermo)檢測各樣品在450 nm處的吸光值。通過將所測吸光度值代入標準曲線計算得到血漿皮質醇含量。

1.8 數據統計與分析

分別利用Levene檢驗和Shapiro-Wilk檢驗對數據的方差齊性和正態性進行檢驗, 對不符合的數據進行平方根反正弦變換以滿足相關統計分析要求。利用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗不同鹽度條件下不同凡納濱對蝦家系間的耗氧率、排氨率、機體ATP含量、丙酮酸激酶酶活、Na+/K+-ATPase酶活、Ca2+-ATPase酶活和血漿皮質醇含量差異。并通過Tukey檢驗(Post-hoc Tukey tests)進行多重比對, 明確組間的顯著性差異。所有統計分析均在R統計分析軟件(R Development Core Team, 2012)中進行, 采用P＜0.05 作為顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 不同鹽度條件下各家系對蝦的生長率、存活率和評分

從表2中可以看出, 總體而言30個對蝦家系的總特定生長率隨著鹽度的下降而顯著降低(P＜0.05), 但每個家系的對蝦在不同鹽度條件下的表現具有差異。部分家系(如家系6010)的對蝦在不同鹽度條件下生長率并無顯著差異(P＞0.05)。此外, 水體鹽度為5‰時, 各家系對蝦的存活率均顯著低于飼養于高鹽度水體時的存活率。根據總評分可見, 此次實驗所選用的30個對蝦家系中, 鹽度適應能力最強的兩個家系為家系6016和6022, 鹽度適應能力最差的兩個家系為家系6039和6040。

2.2 不同鹽度條件下不同家系的耗氧率和排氨率

當水體鹽度為30‰時, 家系6016和6022對蝦的耗氧率顯著高于家系6039和6040(P＜0.05)。在養殖水體鹽度為20‰和5‰時, 家系6016對蝦的耗氧率和排氨率均顯著高于家系6039和6040(圖1,P＜0.05)。從圖1中可以看出, 4個家系對蝦的耗氧率隨著鹽度的降低均顯著降低(P＜0.05)。20‰鹽度組家系6016和6022的排氨率顯著低于30‰鹽度組, 但當鹽度為5‰時, 家系6016和6022的排氨率較30‰鹽度組顯著升高(P＜0.05)。然而, 家系6039和6040對蝦的排氨率在鹽度為5‰時較30‰和20‰顯著下降(P＜0.05)。

表2 不同鹽度條件下30個凡納濱對蝦家系的生長率和存活率(均值±標準誤)突出顯示部分加注英文Tab.2 The growth and survival rates of 30 families of Litopenaeus vannamei under different salinity conditions (Mean±SE)

圖1 不同鹽度條件下四個家系凡納濱對蝦的(A)耗氧率和(B)排氨率(均值±標準誤)Fig.1 Respiration rates (A) and ammonium excretion rates (B) of Litopenaeus vannamei from 4 families possessing the highest and the lowest salinity adaptive ability at salinity of 5‰, 20‰, and 30‰ (Mean±SE)

2.3 不同鹽度條件下不同家系對蝦肌肉ATP含量和丙酮酸激酶酶活力

從圖2中可以看出, 4個家系的對蝦肌肉ATP含量隨著鹽度的下降均顯著降低(P＜0.05)。在3個鹽度水平中, 家系6016和6022對蝦肌肉組織的ATP含量都顯著高于家系6039和6040(P＜0.05)。與此同時, 家系6016和6022對蝦肌肉中丙酮酸激酶酶活力也顯著高于家系6039和6040(P＜0.05)。在鹽度為5‰時, 家系6016和6022對蝦肌肉組織的丙酮酸激酶酶活力相比較高鹽度組有顯著升高(P＜0.05, 圖3)。

2.4 不同鹽度條件下不同家系對蝦鰓Ca2+-ATPase和Na+/K+-ATPase酶活

從圖4可以看出, 不同家系凡納濱對蝦鰓Ca2+-ATPase和Na+/K+-ATPase酶活在鹽度為30‰時并無顯著性家系差異(P＞0.05)。但當鹽度降至5‰時, 家系6012和6022對蝦鰓Ca2+-ATPase和Na+/K+-ATPase酶活水平顯著高于家系6039和6040(P＜0.05)。此外, 4個家系對蝦鰓Ca2+-ATPase酶活水平在鹽度為5‰時較30‰顯著升高(P＜0.05)。

2.5 不同鹽度條件下不同家系對蝦血漿皮質醇濃度

圖2 不同鹽度條件下四個家系凡納濱對蝦肌肉ATP含量(均值±標準誤)Fig.2 ATP contents in the muscle of Litopenaeus vannamei from 4 families possessing the highest and the lowest salinity adaptive ability at salinity of 5‰, 20‰, and 30‰ (Mean±SE)

圖3 不同鹽度條件下四個家系凡納濱對蝦肌肉丙酮酸激酶酶活力(均值±標準誤)Fig.3 Activities of pyruvate kinase in the muscle of Litopenaeus vannamei from 4 families possessing the highest and the lowest salinity adaptive ability at salinity of 5‰, 20‰, and 30‰ (Mean±SE)

圖4 不同鹽度條件下四個家系凡納濱對蝦鰓(A)Ca2+-ATPase和(B)Na+/K+-ATPase酶活力(均值±標準誤)Fig.4 Activities of Ca2+-ATPase (A) and Na+/K+-ATPase (B) in the gill of Litopenaeus vannamei from 4 families possessing the highest and the lowest salinity adaptive ability at salinity of 5‰,20‰, and 30‰ (Mean±SE)

圖5 不同鹽度條件下4個家系凡納濱對蝦血漿皮質醇濃度(均值±標準誤)Fig.5 Plasma cortisol concentrations of Litopenaeus vannamei from 4 families possessing the highest and the lowest salinity adaptive ability at salinity of 5‰, 20‰, and 30‰ (Mean±SE)

從圖5可以看出, 在養殖水體鹽度為30‰和20‰時, 4個家系對蝦血漿皮質醇沒有顯著性家系間差異(P＞0.05)。但當鹽度降至5‰時, 家系6036和6039對蝦血細胞內皮質醇濃度顯著高于另外2個家系(P＜0.05)。此外, 家系6016和6022血液中皮質醇濃度在3個鹽度水體中并無顯著差異(P＞0.05), 而家系6039和6040的血漿皮質醇濃度顯著高于其在30‰和20‰時的濃度(P＜0.05)。

3 討論

3.1 不同凡納濱對蝦家系對鹽度的適應能力

盡管凡納濱對蝦是一種廣鹽性(2‰—40‰)蝦類, 但養殖水體的鹽度仍是影響凡納濱對蝦生長性能的重要因素, 凡納濱對蝦對不同鹽度條件下的適應性也吸引了海內外學者的廣泛關注[21—23]。本研究對比了30個凡納濱對蝦家系在3個鹽度下(5‰、20‰和30‰)的特定生長率和存活率, 結果表明不同遺傳背景的凡納濱對蝦在不同鹽度條件下的生長性能和適應能力存在顯著差異, 這可能是由于不同家系對環境變化的適應能力與不同遺傳背景家系的取食、行為競爭相關, 取食、行為競爭能力強的家系更能在相同環境條件下表現出更具優勢的生長、存活等目標性狀。研究結果進一步顯示, 家系6016和6022相比6039和6040表現出了更好的適應能力, 家系6016和6022構建的父母本中均有來自厄瓜多爾自然群體的種蝦, 一方面其遺傳多樣性顯著高于家系6039和6040父母本(養殖群體), 另一方面, 未經馴化的自然群體的取食和行為競爭可能比養殖群體更具優勢, 因此凡納濱對蝦對鹽度的適應性與遺傳背景密切相關。而造成這一現象的原因很可能是不同家系凡納濱對蝦的能量代謝水平和滲透壓調節能力有所不同。

3.2 血漿皮質醇濃度對低鹽適應能力的影響

無論是在哺乳動物或是水生無脊椎動物中, 血漿皮質醇激素含量都被用作衡量機體應對環境變化能力的重要指標[17]。在本次研究中, 家系6039和6040兩組對蝦的血漿皮質醇濃度在水體鹽度為5‰時顯著高于另外兩組, 說明這兩組對蝦在經30d飼養后仍不能適應低鹽的水體條件。此外, 皮質醇也是調節機體代謝的重要激素, 皮質醇升高也會導致機體組織對能量的利用率降低[24,25]。因此,家系6039和6040兩組對蝦血漿皮質醇濃度升高也可能是導致其在低鹽條件下生長率和存活率降低的重要原因。

3.3 Ca2+-ATPase和Na+/K+-ATPase酶活對低鹽適應能力的影響

由于海水的鹽度一直處于動態變化之中, 海洋中的無脊椎動物就需要通過多種方式維持體內的滲透壓穩定[26,27]。例如, 當水域鹽度降低時, 對蝦可以通過外排Na+、Cl-等離子和分解氨基酸使體內的滲透壓降低以保證細胞和體液的滲透壓相對平衡[28]。在此過程中, 離子的轉運主要是通過位于鰓內薄層隔膜細胞內的Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶等多種離子轉運酶來完成[29]。例如丁森等[30]研究發現, 中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)在水體鹽度為15‰時的機體Na+/K+-ATP酶活力顯著低于其在鹽度為5‰時的水平。與之類似, 本研究發現當海水鹽度下降至5‰時, 家系6016和6022組對蝦鰓細胞內的Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力較鹽度為30‰和20‰時顯著上升。而家系6039和6040對蝦鰓的Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力則顯著低于更適應鹽度變化的兩個家系, 較低的相應酶活力水平會限制對蝦在低鹽環境下的滲透壓調節能力, 這也可能是造成家系6039和6040對蝦鹽度適應能力差的重要原因。

3.4 ATP含量和丙酮酸激酶酶活力對低鹽適應能力的影響

除此之外, 生物體內離子的轉運是一個耗能的過程, 機體代謝水平降低或是ATP合成不足都將削弱對蝦機體在低鹽環境中的離子外排能力[31,32]。在本研究中, 所有4個家系對蝦機體ATP含量均隨著水體鹽度的下降而顯著降低。這是因為當海洋無脊椎動物的體液在等滲點時, 機體維持滲透壓所需能量較少, 但當外界環境鹽度過低時, 機體就需要消耗體內的ATP并同時提高機體能量合成及機體代謝水平以穩定滲透壓[32—34]。本研究中家系6016和6022對蝦的代謝水平在低鹽度條件下顯著升高, ATP合成關鍵酶丙酮酸激酶酶活也顯著上調,但家系6039和6040對蝦機體的丙酮酸激酶酶活在3個不同鹽度環境下未有顯著變化, 這可能是導致該兩組對蝦體內ATP含量相對較低的原因, 這也進一步限制了其在低鹽度條件下的滲透壓調節。

綜上所述, 本研究表明不同遺傳背景的對蝦對鹽度的適應能力不同, 這可能主要是由其機體代謝、離子轉運及能量合成能力所決定。