響應面試驗優化草魚鱗膠原蛋白鈣結合肽的制備

許青，徐昕，公麗艷，張葉帆，楊平

沈陽師范大學（沈陽 110034）

鈣參與人體內細胞內代謝、凝血、神經傳導、骨骼生長等重要功能[1]，是維持人類健康的重要礦物質。鈣在偏堿性環境下的腸道溶解性不好，生物可利用率較低。通常食用的谷物中鈣含量難以達到3.3%的推薦攝入量[2]。低聚肽作為一種易吸收、高容量的協同轉運載體[3]，具有吸收利用率高、排泄率低、消化穩定性好、毒性低等特點[4]。由于低聚肽有獨立的轉運系統，能攜鈣轉運，不僅有利于肽和鈣2種營養素吸收，還可防止補鈣造成的高鈣血癥[5]。研究發現，三文魚骨膠原[6]、大豆蛋白水解產物[7]、蛋清酶肽[8]等都具有較高鈣結合活性，能促進體內鈣的吸收和利用。利用食品工業的副產品生產鈣結合肽成為研究熱點。

淡水魚加工產生的魚皮、魚骨、魚鱗等副產物的利用是淡水魚加工業關注的問題之一，草魚是淡水魚中常見的種類，魚鱗中含有豐富膠原蛋白（占魚鱗的50%～70%）。然而，魚鱗中Ⅰ型膠原主要分布在魚鱗內層，外層被羥基磷灰石覆蓋，這些抗性屏障使得魚鱗在加工過程中不易搗碎，故多被用作飼料、生產魚粉或直接丟棄，而用于制備生物活性肽的研究報道較少。試驗以草魚鱗為原料，采用雙酶協同酶解，響應面優化酶解膠原蛋白鈣結合肽的最佳工藝條件，制備出高活性鈣結合肽，為利用草魚加工副產物，提高其附加值，開發補鈣產品提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草魚鱗，經冷水洗凈后，保存于-18 ℃下備用。

復合蛋白酶（1.5 AU/g）、中性蛋白酶（0.8 AU/g）、堿性蛋白酶（2.4 AU/g）和風味蛋白酶（500 LAPU/g）（丹麥Novozymes公司）；其余試劑均為國產分析純。

HH-6型數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；BCD-198型冰箱（博西華家用電器有限公司）；X-12R型高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；Scientz-12N型冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（上海力辰儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 膠原蛋白鈣結合肽的制備方法

新鮮魚鱗洗凈、絞碎→按料液比1∶10（g/mL）加入0.5 mol/L乙酸溶液，于50 ℃提取24 h→8 000 r/min離心20 min→取沉淀→凍干→加磷酸緩沖溶液→酶解2 h→100 ℃滅酶10 min→10 000 r/min離心30 min取上清液→超濾膜超濾（截留分子質量為1 000 Da）→凍干→-18 ℃下儲存備用

1.2.2 水解度的測定

蛋白酶解水解度（DH）的測定采用pH-stat法[9]。

1.2.3 鈣結合率的測定

將5 mmol/L CaCl2和20 mmol/L pH 7.8磷酸鹽緩沖液混合，形成磷酸鈣沉淀，加入制備的低聚肽，37 ℃恒溫振蕩2 h，以10 000 r/min離心15 min，鄰甲酚酞絡合酮比色法[10]測定上清液可溶性鈣結合率。

1.2.4 蛋白酶的篩選

選取復合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶4種蛋白酶，在酶推薦的條件下酶解3 h，酶解條件見表1。取0.1 g提取的膠原蛋白，依次加入10mL磷酸緩沖溶液、10 mg蛋白酶，以鈣結合率和DH為指標，篩選試驗用酶。

表1 不同蛋白酶水解試驗條件

1.2.5 單因素試驗

以鈣結合率和水解度為指標，分別考察復合蛋白酶與風味蛋白酶質量比（1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2和9∶1）、酶解時間（1，2，3，4，5和6 h）、pH（6.0，6.5，7.0，7.5和8.0）、酶解溫度（25，30，35，40，45和50 ℃）、底物濃度（1，5，10，15和20 g/L）5個因素對鈣結合率和DH的影響。

1.2.6 響應面優化鈣結合肽的試驗

根據中心組合設計原理，以鈣結合率和DH為響應值，選擇復合蛋白酶與風味蛋白酶質量比、酶解溫度、酶解時間為自變量，進行三因素三水平的響應面優化試驗。

1.2.7 數據分析

采用Design-Expert 10軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

由表2可見，4種蛋白酶的酶解產物均有一定鈣結合能力，復合蛋白酶酶解產物的鈣結合率和DH最高，其次是中性蛋白酶、堿性蛋白酶和風味蛋白酶。復合蛋白酶和中性蛋白酶的水解條件接近，適合同步雙酶解，因此選擇復合蛋白酶和中性蛋白酶對魚鱗膠原蛋白協同酶解。

2.2 酶解條件的單因素試驗結果

2.2.1 復合蛋白酶與中性蛋白酶質量比對酶解反應的影響

由圖1所示，復合蛋白酶與中性蛋白酶質量比6∶4時，膠原蛋白的DH最高，達到20.31%，酶質量比5∶5時，鈣結合率最為19.01%。不同蛋白酶的特異酶切位點不同，酶解產物有所不同[11]。雙酶協同酶解時由于增加水解的主要位點，相對于單酶解，可獲得更多的鈣結合位點，提高DH和短肽率。因此，選取復合蛋白酶與中性蛋白酶質量比5∶5。

表2 蛋白酶對膠原蛋白酶解效果的影響

圖1 酶質量比對鈣結合肽DH和鈣結合率的影響

2.2.2 底物濃度對酶解反應的影響

由圖2所示，隨著底物濃度增大，可溶性鈣結合率和DH先增加后降低，底物質量濃度15 g/L時達到最大，底物質量濃度繼續增加到20 g/L時可溶性鈣結合率和DH均明顯下降。底物質量濃度較低時，底物可與酶充分接觸，隨著底物質量濃度繼續增加，膠原蛋白逐漸成凝膠狀態，影響鈣與肽的充分接觸，致使肽與鈣結合率降低。因此，選取膠原蛋白酶解底物質量濃度15 g/L。

圖2 底物質量濃度對鈣結合肽DH和鈣結合率的影響

2.2.3 酶解pH對酶解反應的影響

由圖3可知，在pH 5.5～7.5范圍內，pH對鈣結合率和DH的影響差異不顯著（p＞0.05），pH 7時鈣結合率和DH達到最大值，分別為28.2%和25.58%。因此，選取酶解pH 7。

2.2.4 酶解溫度對酶解反應的影響

由圖4可知，酶解溫度40～65 ℃時，隨著酶解溫度升高鈣結合率和DH均先升后降，酶解溫度55 ℃時達到最高值，酶解溫度大于55 ℃時鈣結合率和DH都明顯下降（p＜0.05）。溫度是影響酶促反應的一個重要因素，酶解溫度超過該酶的最適反應溫度時，酶會出現不同程度變性，降低反應速率。因此，選取酶解反應溫度50 ℃。

圖3 酶解pH對鈣結合肽DH和鈣結合率的影響

圖4 酶解溫度對鈣結合肽DH和鈣結合率的影響

2.2.5 酶解時間對酶解反應的影響

由圖5可知，隨著酶解時間的延長，鈣結合率和DH不斷提高，酶解4 h鈣結合率和DH達到最大值，分別為28.37%和30.23%；水解時間3和4 h的鈣結合率和DH差異不顯著（p＞0.05），因此，選取酶解時間3 h。

圖5 酶解時間對鈣結合肽DH和鈣結合率的影響

2.3 響應面優化膠原蛋白鈣結合肽酶解的結果

2.3.1 響應面優化試驗方案及結果

根據單因素試驗結果，選擇雙酶質量比、酶解溫度、酶解時間為自變量，以膠原蛋白鈣結合肽的鈣結合率和DH為響應值，進行三因素三水平Box-Behnken響應面試驗，具體設計方案及結果如表3所示。

表3 膠原蛋白鈣結合肽響應面優化試驗方案及結果

2.3.2 模型方程的建立及顯著性分析

肽結合鈣率的二次回歸模型顯著性分析如表4所示，肽鈣結合率與各因素的響應函數（回歸方程）為Y=32.76+2.51A-2.81B+1.79C+4.43AB-3.64AC-1.49BC-9.2A2-3.03B2-4.31C2（Y，指鈣結合率；A、B、C分別代表雙酶質量比、底物濃度、酶解溫度），回歸模型的F=34.30，達到極顯著水平（p＜0.01），失擬項F=4.62，不顯著（p＞0.05），說明鈣結合率的模型建立良好。水解度的二次回歸模型顯著性分析如表5所示，水解度與各因素的響應函數（回歸方程）為Y=48.83+2.07A-4.35B+5.47C+2.38AB-6.80AC-1.78BC-11.45A2-3.51B2-5.54C2?；貧w模型的F=293.98，達到極顯著水平（p＜0.01），失擬項F=0.33，不顯著（p＞0.05），說明肽水解度的模型建立良好。

表4 鈣結合率的二次回歸方程方差分析結果

表5 水解度的二次回歸方程方差分析結果

2.3.3 響應面的交互效應分析

圖6顯示以鈣結合率和DH為響應值的趨勢圖。響應面圖彎曲程度，可反映因素間交互作用對鈣結合率的影響程度，彎曲程度越高，說明2個因素的作用越顯著?？梢钥闯?，酶質量比、底物質量濃度及溫度之間的交互作用均顯著（p＜0.05），肽的鈣結合率在3個因素均適宜情況下才會達到最大值。

圖6 各因素交互作用對鈣結合肽鈣結合率和DH的影響

2.4 驗證試驗結果

為獲得鈣結合能力強的低聚肽，以鈣結合率為響應值，分析得出影響因素的最佳組合為復合蛋白酶與風味蛋白酶質量比6∶4、底物質量濃度18.75 g/L、酶解溫度51.5 ℃，預測鈣結合率為33.43%。為檢驗模型預測的準確性，在該酶解條件下試驗測得鈣結合率為32.93%±0.84%，與預測值接近。

3 結論

酶解技術在魚副產品加工的應用越來越廣泛，試驗以草魚鱗為原料，采用復合蛋白酶與中性蛋白酶協同酶解鈣結合肽，建立以鈣結合率為響應值，以酶質量比、底物濃度及水解溫度為自變量的數學模型，得到復合蛋白酶與風味蛋白酶質量比6∶4、底物質量濃度18.75 g/L、酶解溫度51.5 ℃條件下，此酶解條件下的低聚肽鈣結合率為33.43%。試驗利用雙酶解制備魚鱗膠原蛋白鈣結合肽，獲得有較高鈣結合能力的低聚肽酶解工藝，可為草魚加工副產品的深加工提供理論依據。