過表達蛋白合成與分泌相關蛋白提高CHO細胞anti- hLAG3產量

劉立蘋 喻長遠 許立達

(北京化工大學 生命科學與技術學院，北京 100029)

引 言

自1982年禮來公司推出重組人胰島素以來，生物制藥在市場擴展和技術方面取得了很大進展[1]。隨著人們對治療性蛋白市場需求的不斷增加，對重組蛋白生產宿主生產能力的要求也越來越高。中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)細胞作為最常用的哺乳動物細胞生產宿主，相比于其他細胞類型具有以下幾個關鍵優勢：1)能夠在化學成分清晰的無血清培養基中高密度生長；2)不易傳播人類病毒；3)能夠對表達的重組蛋白進行與人類相似的翻譯后修飾；4)容易產生工程化細胞克隆，該細胞克隆可對目的基因進行高效且穩定的表達[2]。雖然具有上述優勢，但是CHO細胞在生長能力和蛋白表達能力方面仍有待提高。

大部分治療性蛋白為分泌型蛋白，如單克隆抗體、干擾素γ、促紅細胞生成素等[3]。由于內質網在分泌途徑中起著至關重要的作用，因此，不少學者研究了內質網蛋白和重組蛋白產生之間的相互關系。例如，Ku等[3]分別在CHO細胞和小鼠骨髓瘤細胞NS0中過表達X盒結合蛋白1的剪切形式(spliced form of X-box binding protein 1, XBP1s)，研究該蛋白對這2種細胞分泌單克隆抗體、干擾素γ和促紅細胞生成素的影響，結果表明，當合成重組蛋白的量超過了宿主細胞的分泌能力時，XBP1s能夠顯著提高重組蛋白的產量。除了XBP1s外，免疫球蛋白重鏈結合蛋白質(immunoglobulin heavy chain binding protein, BiP)、轉錄激活因子6(activating transcription factor 6, ATF6)[4]、真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α)[5]、轉錄激活因子4(activating transcription factor 4, ATF4)[6]、生長停滯和DNA損傷誘導蛋白34(growth arrest and DNA damage inducible protein 34, GADD34)[7]等也都在內質網的未折疊蛋白反應(UPR)中發揮重要作用。除了上述蛋白，其他一些蛋白質，如鈣連蛋白(calnexin, CNX)[8]、鈣網蛋白(calreticulin, CRT)[8]、蛋白質二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase, PDI)[9]、信號識別顆粒14(signal recognition particle 14, SRP14)[10]等也都被報道能夠促進細胞的重組蛋白合成或分泌。

瞬時表達系統相對于穩定表達系統具有快速高效的優點，尤其適用于候選重組蛋白的初期研發。ExpiCHO- S細胞是一株能夠適應高密度培養的懸浮細胞，被廣泛用于重組蛋白的瞬時表達。LAG3(lymphocyte activation gene 3)為淋巴細胞激活基因，是一個潛在的腫瘤免疫治療靶點。但目前用ExpiCHO- S細胞瞬時表達anti- hLAG3的水平較低，為了提高該抗體的表達水平，研究了過表達蛋白合成與分泌相關蛋白對ExpiCHO- S細胞生長和anti- hLAG3生產的影響，為該細胞的工程化改造提供依據，同時也為其他重組蛋白生產細胞的工程化改造提供借鑒。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

ExpiCHO- S細胞購于Thermo Fisher Scientific公司；LAG3- Relatlimab- IgG4由本實驗室合成；pCAG- Hygro載體、pCAG- Hygro- IRES2- EGFP載體、大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α由本實驗室保存；ExpiCHO- S細胞培養及表達所用培養基為ExpiCHO Expression Medium，絡合培養基為Gibco OptiPRO SFM，細胞轉染所用試劑為ExpiFectamine CHO試劑，均購于Thermo Fisher Scientific公司；臺盼藍購于美國Amresco公司。

恒溫震蕩培養箱(ISF1- X型，瑞士Adolf Kuhner公司)，流式細胞儀(BD LSRFortessa型，美國BD公司)，實時熒光定量PCR儀(qRT- PCR)(ABI PRISM 7000型，美國ABI公司)，細胞計數儀(Countstar型，上海睿鈺生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1重組表達質粒構建

human XBP1s、human ATF6c、CHO ATF4、human E2F1、Bovine eIF2α、CHO GADD34、CHO NFKBIz、human C/EBPα、human BiP、CHO CRT、CHO CNX、CHO PDI、CHO ERP57、human SLY1、human vAMP8、human SRP14、human Munc18c、human SNAP- 23、human CERT和human mTOR共20種蛋白的基因序列由其氨基酸序列(www.uniprot.org/)經密碼子優化后由北京擎科生物科技有限公司合成，隨后由本實驗室構建表達載體，連接載體時所用的酶切位點為NheⅠ和BamH Ⅰ，引物信息如表1所示。表達載體構建完成后通過基因測序驗證其是否連接正確。

為檢測上述蛋白的表達載體在細胞中的轉染效率，在這些蛋白的基因后連接增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因作為報告基因，之間用IRES2連接，重組表達質粒圖譜見圖1。

圖1 重組表達質粒圖譜Fig.1 Recombinant expression plasmid map

1.2.2細胞轉染

于24孔深孔板中每孔接種6×106個/mL的ExpiCHO- S細胞2.5 mL。取1.5 mL無菌離心管，加入192 μL Gibco OptiPRO SFM，然后加入2 μg質粒DNA，輕柔混勻后加入8 μL ExpiFectamine CHO試劑，再次輕柔混勻，立即加入準備好的細胞懸液中。在2 μg質粒DNA中，LAG3- Relatlimab- IgG4質粒輕重鏈(1∶1，質量比)共1.6 μg，蛋白合成與分泌相關蛋白的質粒為0.4 μg。將細胞置于37 ℃、8% CO2、200 r/min的恒溫震蕩培養箱中培養。在轉染后18～22 h內加入15 μL Enhancer和600 μL Feed。

1.2.3轉染效率測定

取30 μL轉染后培養72 h的細胞懸液，1 200 r/min離心5 min，棄上清，用無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，再用50 μL PBS重懸細胞，用流式細胞儀檢測EGFP的表達情況。陰性對照細胞為轉染了pCAG- Hygro載體和anti- hLAG3輕重鏈的ExpiCHO- S細胞，以及轉染了pCAG- Hygro- IRES2- EGFP載體和anti- hLAG3輕重鏈的ExpiCHO- S細胞，并分別記為Null和EGFP。各基因的表達載體在細胞中的轉染效率采用FlowJo 7.6分析，根據陰性對照細胞畫門，再應用到所有處理細胞上，即可得到各基因的轉染效率。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.4qRT-PCR測定XBP1s轉錄水平

從瞬時轉染后培養48 h的ExpiCHO- S細胞中提取總RNA，隨后反轉錄得到cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)作為內參進行qRT- PCR分析。所用試劑盒為Power SYBR?Green PCR Master Mix Kit(美國ABI公司)。采用2-ΔΔCt法計算XBP1s的mRNA相對含量。引物序列如表2所示。

表2 qRT- PCR所用引物Table 2 Primers used in qRT- PCR

1.2.5活細胞密度及細胞活率檢測

吸取20 μL細胞懸液，加入20 μL 1 g/L臺盼藍，混勻，用細胞計數儀測定活細胞密度和細胞活率。

1.2.6抗體產量及親和力檢測

用Biacore 8K生物分子相互作用分析系統(美國GE公司)分析細胞上清中anti- hLAG3抗體的產量，檢測芯片為Protein- A，緩沖液為pH 7.4的HBS- EP溶液，再生液為pH 2.0的Glycine溶液。

Anti- hLAG3與hLAG3間的親和力測定同樣采用Biacore 8K分析系統。使用Protein- A芯片在流速為10 μL/min的條件下，捕獲上清中的anti-hLAG3，并對anti-hLAG3與25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78 nmol/L和0 nmol/L濃度的hLAG3蛋白進行動力學檢測，流速為30 μL/min，結合和解離時間分別為180 s和600 s。使用Biacore 8K Insight Evaluation Software軟件進行數據的擬合分析，得到結合常數Ka和解離常數Kd。通過式(1)計算平衡解離常數KD。

KD=Kd/Ka

(1)

所有數據的測量均不少于3個平行，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 過表達蛋白合成與分泌相關蛋白對ExpiCHO- S細胞的抗體產量和轉染效率的影響

哺乳動物細胞的蛋白合成和分泌能力能夠直接影響重組蛋白的產量。因此，通過過表達蛋白合成與分泌途徑中的關鍵蛋白有望提高細胞的重組蛋白產量。將參與蛋白合成與分泌的20種蛋白的基因與anti- hLAG3的抗體質粒共轉染入ExpiCHO- S細胞中，檢測轉染后72 h培養物上清中抗體產量的變化。僅轉染了pCAG- Hygro- IRES2- EGFP載體和anti- hLAG3輕重鏈的細胞上清中抗體的產量為24.21 μg/mL。為了更直觀地體現各蛋白對ExpiCHO- S細胞生產anti- hLAG3的影響，將轉染了各蛋白表達載體的細胞上清的抗體產量用相對產量(Cr)表示(式(2))。

Cr=Cm/24.21×100%

(2)

式中，Cm為實測產量(μg/mL)。

如圖2所示，相比于EGFP組，過表達XBP1s后能夠使細胞的抗體產量提高30.56%。而過表達GADD34、NFKBIz、CERT、C/EBPɑ和mTOR后能夠使抗體產量降低到87.18%～71.21%。其他14種蛋白對ExpiCHO- S細胞的抗體產量的影響則較小(抗體產量的變化率<10%)。分析這些蛋白的表達載體在ExpiCHO- S細胞中的轉染效率發現，不同基因在細胞中的轉染效率差異較大，并且不同基因的轉染效率的差異與這些基因對細胞抗體產量影響的差異沒有明顯相關性。

圖2 過表達蛋白合成與分泌相關蛋白對ExpiCHO- S細胞的抗體相對產量和轉染效率的影響Fig.2 Effect of overexpression of proteins related to protein biosynthesis and secretion on relative antibody production and transfection efficiency of ExpiCHO- S cells

2.2 過表達XBP1s、ATF4和BiP對細胞活率和活細胞密度的影響

為了進一步研究蛋白合成與分泌相關蛋白對ExpiCHO- S細胞生長的影響，選取對細胞抗體產量促進作用較明顯的3種蛋白，即XBP1s、ATF4和BiP，研究其對ExpiCHO- S細胞的細胞活率和活細胞密度的影響。

圖3 過表達XBP1s、ATF4和BiP對細胞活率和活細胞密度的影響Fig.3 Effects of XBP1s, ATF4 and BiP overexpression on cell viability and viable cell density

如圖3(a)所示，在對照組(Null和EGFP組)中，轉染后24 h細胞活率有輕微降低，48 h左右時細胞活率恢復，隨后又開始降低，但在穩定期后期細胞活率仍然維持在較高水平(>90%)。與對照組相比，過表達XBP1s和BiP對細胞活率的影響均較小，細胞培養至216 h時細胞活率仍大于90%；過表達ATF4在轉染后前192 h對細胞活率的影響也較小，但當繼續培養到192 h時，細胞活率急劇降低至30.8%，比其他組細胞提前進入衰亡期。

同樣考察了過表達上述蛋白后對ExpiCHO- S活細胞密度的影響，如圖3(b)所示，細胞轉染后前48 h活細胞密度增長迅速，隨后細胞生長逐漸進入穩定期，168 h后由于營養物質的缺乏細胞逐漸進入衰亡期。與對照組相比，過表達XBP1s和BiP對活細胞密度的影響較小。而過表達ATF4雖然能夠輕微提高ExpiCHO- S細胞在指數期的活細胞密度(轉染48 h后的細胞密度由EGFP組的1.20×107個/mL提高到1.37×107個/mL)，但可能由于營養消耗較快，轉染后192 h時活細胞密度即急劇降低，比對照組提前進入衰亡期。Gulis等[11]在CHO細胞中過表達XBP1s，發現其在提高IgG產量的同時，會降低活細胞密度。Pybus等[12]在研究過表達BiP對4種難表達單克隆抗體的影響時也發現10% BiP在提高抗體表達量的同時，會輕微降低活細胞密度。而在本研究中，過表達XBP1s和BiP對ExpiCHO- S細胞的活細胞密度和細胞活率的影響均較??；過表達ATF4雖然在細胞培養前期能夠輕微提高活細胞密度，但會使細胞提前進入衰亡期。表明ExpiCHO- S細胞受蛋白的影響會隨過表達蛋白種類的變化而不同。

2.3 過表達XBP1s、ATF4和BiP對轉染效率和抗體產量的影響

如圖4(a)所示，轉染后72 h，XBP1s、ATF4和BiP的表達載體在ExpiCHO- S細胞中的轉染效率分別為26.9%、25.8%和38.2%。在168 h之前，隨著培養時間的延長，轉染效率逐漸降低。分析3種蛋白的過表達對抗體產量的影響發現(圖4(b))，XBP1s能夠明顯提高ExpiCHO- S細胞的抗體產量，相比于對照組(EGFP組)，使216 h時的抗體產量提高了27.4%。而在抗體生產的整個過程中，過表達ATF4和BiP對anti- hLAG3產量的影響均較小。

圖4 過表達XBP1s、ATF4和BiP對轉染效率和抗體產量的影響Fig.4 Effects of XBP1s, ATF4 and BiP overexpression on transfection efficiency and antibody production

XBP1s是內質網UPR中肌醇需求酶1(IRE1)/XBP1信號通路的關鍵因子，能夠誘導分子伴侶和內質網蛋白降解途徑中相關蛋白的表達。因此，XBP1s能夠通過協助未折疊蛋白進行折疊并使未折疊蛋白降解而緩解內質網壓力[6]。在現有文獻中，XBP1s對哺乳動物細胞分泌重組蛋白的影響的爭議較大。例如，Tigges等[13]研究了過表達人源XBP1s對CHO- K1細胞產分泌型堿性磷酸酶(SEAP)和分泌型α淀粉酶(SAMY)的影響。結果發現，XBP1s能夠使SEAP和SAMY的產量分別提高到6倍和4倍，其介導的產量增加與產物的轉錄水平無關，而是通過克服分泌系統的分泌瓶頸實現產量的增加。此外，該研究還發現XBP1s對人源細胞系，包括HEK- 293、HeLa和HT- 1080細胞的異源蛋白生產無影響，并且其只能增加分泌型蛋白的產量。而Ku等[3]研究發現，過表達鼠源XBP1s對穩定表達單克隆抗體、干擾素γ和促紅細胞生成素的CHO細胞的重組蛋白表達均沒有顯著影響，進一步研究發現只有當重組蛋白的產量達到細胞分泌上限時，過表達XBP1s才能夠通過提高細胞分泌能力而提高蛋白產量；反之，蛋白產量則主要受轉錄及翻譯水平調控。而在本研究中，XBP1s能夠明顯提高ExpiCHO- S細胞瞬時表達anti- hLAG3的產量，表明XBP1s對重組蛋白產量的提高可能不受蛋白來源和分泌瓶頸的限制。

ATF4屬于轉錄激活因子/環狀AMP響應元件結合蛋白(ATF/CREB)家族的堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子，具有共有結合位點cAMP響應元件[14]。ATF4由包括缺氧/低氧、內質網應激、氨基酸剝奪和氧化應激在內的應激信號誘導。ATF4可增強UPR靶基因子集，包括GADD34和C/EBP同源蛋白(CHOP)的表達。ATF4也被UPR翻譯上調。Ohya等[6]發現，在CHO細胞中過表達ATF4能夠使培養液中抗凝血酶III的產量提高66.7%。而在本研究中，ATF4對anti- hLAG3產量的影響較小，其原因還有待進一步研究。

BiP，也稱為GRP78，是一種內質網駐留蛋白，能夠與許多不完全折疊和未組裝的蛋白結合。對于許多分泌或膜結合蛋白，其與BiP的結合是瞬時的；而對于折疊錯誤、糖基化不當或其他分泌不足的蛋白質，其與BiP的結合可以更穩定。Pybus等[12]發現，在CHO細胞中過表達BiP能夠提高難表達mAb的比生產速率，但同時也會降低細胞生長速率。 Dorner等[15]則發現降低內源性BiP的表達量能夠提高異源蛋白的分泌。在本研究中，BiP對ExpiCHO- S細胞抗體生產的影響則較小。

2.4 XBP1s共轉染比例對轉染效率、XBP1s轉錄水平和抗體產量的影響

通過調整瞬時轉染過程中XBP1s表達質粒和anti- hLAG3表達質粒的轉染比例，研究不同XBP1s共轉染比例(以XBP1s表達質粒占總轉染質粒的質量分數表示，下同)對ExpiCHO- S細胞表達重組抗體的影響，結果見圖5。

圖5 XBP1s共轉染比例對轉染效率、XBP1s轉錄水平和抗體產量的影響Fig.5 Effect of XBP1s co-transfection ratio on transfection efficiency,XBP1s transcription level and antibody production

如圖5(a)所示，隨著轉染過程中XBP1s表達質粒比例的增加，其在ExpiCHO- S細胞中的轉染效率逐漸增加。并且在同一比例下，隨著培養時間延長，XBP1s的轉染效率降低。具體地，當XBP1s的共轉染比例由10%提高到60%時，轉染后72 h時的轉染效率由13.85%提高到32.6%。通過qRT- PCR分析不同共轉染比例的XBP1s在細胞中的轉錄水平發現(圖5(b))，當XBP1s共轉染比例≥20%時，隨著共轉染比例的增加，其在細胞中的轉錄水平也增加，并且相對于XBP1s共轉染比例為0%時，能夠使XBP1s轉錄水平提高到1.5～2.8倍。

測定不同共轉染比例的XBP1s對抗體產量的影響發現(圖5(c))，隨著XBP1s轉染比例的提高，相對于相同共轉染比例的EGFP，XBP1s對細胞抗體生產的促進作用也逐漸增強。除10% XBP1s會輕微降低anti- hLAG3的抗體產量外，20%的XBP1s能夠使anti- hLAG3在168 h時的抗體產量提高39.6%，當XBP1s的共轉染比例提高到60%時，在168 h時的抗體產量提高到2.1倍，由共轉染60%EGFP時的66.7 μg/mL提高到141.5 μg/mL。上述結果表明XBP1s在促進CHO細胞重組抗體生產方面有很大潛力。

2.5 過表達XBP1s對anti- hLAG3親和力的影響

為進一步研究過表達XBP1s對anti- hLAG3抗體質量的影響，測定了XBP1s共轉染比例為60%時，anti- hLAG3對hLAG3的親和力變化。如表3所示，相比于對照藥Relatlimab，過表達XBP1s后anti- hLAG3對hLAG3的KD值變化較小(8.40×10-11vs. 9.99×10-11mol/L)，表明過表達XBP1s對anti- hLAG3的親和力基本無影響。

表3 過表達XBP1s對anti- hLAG3與hLAG3的親和力的影響Table 3 Effect of XBP1s overexpression on theaffinity of anti- hLAG3 to hLAG3

3 結論

(1)對比研究了過表達20種參與調控蛋白合成與分泌途徑的蛋白對ExpiCHO- S細胞表達抗體anti- hLAG3產量的影響，發現過表達XBP1s能夠明顯提高抗體產量。

(2)提高XBP1s的共轉染比例能夠增強其對anti- hLAG3表達的促進作用，當XBP1s的共轉染比例提高到60%時，相對于相同共轉染比例的EGFP，168 h時的抗體產量可以提高到2.1倍。

(3)XBP1s的過表達對細胞生長及抗體的親和力影響均較小。通過構建穩定過表達XBP1s的細胞株有望進一步提高該蛋白對抗體產量的促進作用?？偟膩碚f，XBP1s有望用于提高CHO細胞的重組蛋白生產力。