抗丙型肝炎病毒天然產物的研究進展

馬 穎，金永生 （. 煙臺大學藥學院，山東 煙臺 64005；. 海軍軍醫大學藥學院，上海 00433）

根據WHO 的數據，每年約有399 000 人死于與丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）感染有關的肝病。目前，尚沒有疫苗可用于預防HCV 感染。HCV 是黃病毒科中一種有包膜的正鏈單鏈RNA 病毒。HCV 基因組RNA 編碼為一種多聚蛋白，這種多聚蛋白可以被宿主和病毒的蛋白酶切割轉化為成熟蛋白，其中包括：核心蛋白、糖蛋白E1 和E2（組成結構蛋白）、離子通道p7 和非結構蛋白，包括NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B等。非結構病毒蛋白NS3/4A、NS4B、NS5A 和NS5B 組裝并與宿主蛋白相互作用，形成病毒復制復合物。非結構蛋白之一的NS5B 是一種HCV 復制酶，它也是一種RNA 依賴的RNA 聚合酶（RdRp），可以復制病毒RNA 的基因組[1]。因此，NS 已經成為藥物開發的主要目標[2]。這類以NS 蛋白為靶點的抗丙肝藥物，可以直接殺死HCV，也稱為直接抗病毒藥，例如，蛋白酶抑制劑特拉匹韋（telaprevir）或西咪匹韋（simeprevir）和RNA 聚合酶抑制劑索磷布韋（sofosbuvir）對大多數常見HCV 基因型的有效率高達90%，從而提高了持續的病毒學應答率。但是，這些直接抗病毒藥治療可能會導致高昂的治療費用以及一些其他問題：如耐藥性、藥物相互作用，以及疲勞、頭痛、惡心、失眠、甚至貧血等不良反應。因此，針對HCV 生命周期不同階段的新型藥物可能為抗HCV 耐藥性發展和感染復發等提供有前途的方法。

從天然產物中尋找和發現新的活性化合物一直是新藥研究的主要方向之一。近些年來，具有抗HCV 作用的天然化合物越來越受到重視。本文對近年來報道的具有較好活性的天然抗HCV 活性化合物做一綜述，為天然產物抗HCV 研究提供一些思路。

1 具有干擾HCV 復制的天然化合物

NS3 作為HCV 的一種重要的非結構蛋白，在HCV 復制過程中起著重要的作用。NS3 是一種絲氨酸蛋白水解酶，也是病毒解旋酶，可以解螺旋RNA×RNA 和RNA×DNA 二倍體，對病毒復制是非常重要的酶。因此，以NS3 為靶標尋找抗HCV化合物也是抗HCV 藥物研究重要方向之一（圖1）。Lee 等[3]報道從中藥桑白皮的乙醇提取物中分離鑒定了一類2-芳基苯并呋喃類化合物。其中moracin P（1）和moracin O（2）在這類化合物中顯示出對HCV 較強的抑制活性，IC50分別為35.6 和80.8 μmol/L；對NS3 的抑制活性IC50分別為42.9 和27.0 μmol/L。

Zuo 等報道了從黑蕊虎耳草（Saxifraga melanocentra Franch）中分離得到了一類具有HCV 的NS3絲氨酸蛋白水解酶抑制活性的多酚類化合物[4]。其中化合物1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖苷（3）、1,4-二-O-沒食子酰-3,6-(R)-六羥基二苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖（石榴皮鞣質）、1,2,4,6-四-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖苷、1,2,4-三-O-沒食子酰-3,6-六羥基二苯甲?；咸烟牵ㄊ袢~鞣質）和1,3,6-四-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖苷，對NS3 絲氨酸蛋白水解酶抑制活性IC50分別為0.68、0.76、0.81、0.85和1.01 μmol/L。沒食子酸、沒食子酸甲酯、虎耳草素（4）、山奈酚、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷和2′-O-沒食子酰蘆丁，對NS3 絲氨酸蛋白水解酶抑制作用IC50分別為1.76、1.36、1.71、1.61、1.03 和4.86 μmol/L。而槲皮素和蘆丁對NS3 的作用相對較弱，IC50為33.11 和77.05 μmol/L。從構效關系可以發現，較多的沒食子酰結構有利于提高抑制NS3 活性。

Zuo 等[5]報道了從狹葉紅景天Rhodiola kirilowii(Regel) Maxim 中分離得到了4 個(-)-表兒茶素衍生物：紅景天素(5)、3,3′-二沒食子?；ㄇ嗨?6)、(-)-表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯(7, EGCG)和(-)-表兒茶素-3-O-沒食子酸酯 (8, ECG)，它們均顯示出較好的抗HCV NS3 絲氨酸蛋白水解酶活性，其IC50分別為0.77、0.91、8.51 和18.55 μmol/L。從這兩個研究結果可以發現，沒食子酚或者其他具有較多酚羥基結構的天然多酚類化合物具有較好的NS3 絲氨酸蛋白水解酶抑制活性。

從中藥桑寄生醇提物的乙酸乙酯部位分離出10種化合物，其中山奈酚-3,7-雙鼠李糖苷(19.4 μmol/L,9)和(3S)-3-羥基-1,7-雙(4-羥基-苯基)-6E-庚烯-5-酮(28.7 μmol/L, 10)顯示出最強的抗HCV NS3 蛋白酶抑制活性，其他分離得到的黃酮類化合物和二芳基庚類化合物也均具有抗HCV NS3 蛋白酶抑制活性[6]。

從葡萄根提取物中得到的一種白藜蘆醇四聚體vitisin B（11）顯示出對HCV 復制的抑制作用（IC50=6 nmol/L），而且細胞毒性較低（EC50＞10 μmol/L）。與NS5B 聚合酶抑制劑索磷布韋（sofosbuvir）聯合使用時，vitisin B 顯示出協同作用。對vitisin B 耐藥的HCV 變異株研究表明，NS3 解旋酶為其潛在靶標。vitisin B 可以和純化的NS3 解旋酶在體外直接結合，而顯示出強效HCV NS3 解旋酶抑制作用（IC50= 3 nmol/L）。進一步的體內藥動學實驗研究表明，腹腔注射vitisin B 后肝臟可以達到臨床上可接受的濃度[7]。

Wu 等[8]報道了從楝科植物大葉桃花心木（Swietenia macrophylla）枝干中分離得到化合物3-hydroxy caruilignan C (3-HCL-C, 12) 在蛋白和RNA 水平均顯示出較強的抗HCV 活性，EC50=10.5 μmol/L。3-HCL-C 與IFN-α、NS5B 聚合酶抑制劑NM-107(2′-C-methylcytidine)，或者NS3/4A 蛋白水解酶抑制劑特拉匹韋聯合使用，可以顯著增強對HCV 的RNA 復制的抑制作用。

文獻報道[9]五環三萜中的齊墩果酸（13）和熊果酸（14）能顯著抑制HCV 復制，IC50分別為2.9、10.6 μg/ml。而且這種作用部分是通過非競爭性抑制NS5B 依賴性RNA 聚合酶而產生。

從粘桿菌的次生代謝產物中得到的化合物soraphen A（15），具有顯著的抗HCV 活性，EC50為2.30 nmol/L。soraphen A 既不抑制HCV RNA 翻譯，也不抑制HCV 入侵，而是抑制HCV 復制，可能是通過抑制HCV 復制位點的膜質網發揮作用[10]。

Hu 等從美洲小白菊（Parthenium hispitum Raf）中分離鑒定了9 個C14-氧代1α-羥基-11(13)-偽愈創木烯6β，12-內酯類化合物,顯示出較好的抑制HCV 復制的作用[11]。其中化合物16 在2 μmol/L濃度對HCV 的抑制率可達90%。

2 抑制病毒入侵類天然產物

HCV 入侵正常肝細胞，是HCV 完成感染正常肝細胞的最初階段。如果可以阻止病毒對肝細胞的入侵，那么就可以將HCV“拒之門外”，從而起到保護正常細胞的作用。由于大多數藥物開發策略都針對病毒生命周期的復制階段，因此對于研究HCV 入侵抑制劑是抗HCV 藥物的研究重要方向之一（圖2），尤其是在接受肝移植的患者中。

Nakajima 等[12]從海藻、苔蘚等分離出的真菌菌株的代謝產物中，發現了sulochrin（17）具有較好的抑制HCV 活性。sulochrin 是一種funicone 類衍生物，可以以劑量依賴關系降低HCV 對細胞的感染率和HCV 核心蛋白的表達，與空白對照相比，可以降低至其1/3～1/4 水平。而且，在濃度達50 μmol/L時，仍沒有表現出明顯的細胞毒性。進一步采用HCVpp 進行實驗，結果表明sulochrin 可以抑制病毒入侵正常細胞。sulochrin 與干擾素或者特拉匹韋聯合使用，可以顯著增強對抗HCV 作用。構效關系研究表明，1,3-二羥基-5-甲基苯基結構是重要的藥效基團。

從植物葉下珠（Phyllanthus urinaria）分離得到的一種單萜類內酯地蕓普內酯（LOD, 18）是一種新型HCV 抑制劑。LOD 可以有效抑制有利病毒顆粒，抑制病毒黏附和阻止病毒入侵和融合，而對病毒復制或翻譯影響以及I 型IFN 宿主抗病毒免疫反應影響很小?；诿嘎撁庖呶綔y定(ELISA)的結合分析，證實了單萜類化合物能夠有效阻斷HCV顆粒黏附于宿主細胞表面的能力。此外，LOD 可以抑制幾種HCV 基因型菌株的感染。LOD 可能成為抗HCV 藥物的潛在候選藥物[13]。

Qian 等[14]研究發現從五味子中分離得到的五環三萜酸甘五酸（SZA）能有效抑制HCV 入侵肝細胞，卻不會干擾病毒在細胞表面的結合或內在化。但是，在SZA 的作用下，細胞融合過程會受到損害，并且宿主膜的流動性增加。此外，還發現SZA可抑制HCV 向鄰近細胞的擴散，并且SZA 與干擾素或特拉普韋的聯合使用對抗HCV 活性具有協同效應。除此之外，SZA 能夠抑制體內HCV 感染。SZA 靶標不同于常規的抗病毒藥物。因此，SZA是一種用于HCV 抑制劑的潛在治療性化合物，尤其是對于在肝移植過程中需要預防HCV 再感染的患者。

圖1 干擾HCV 復制的天然產物化學結構

圖2 抑制病毒入侵的天然產物化學結構

Bose 等[15]以保肝作用聞名的水果為研究對象，從中篩選尋找HCV 入侵抑制劑，發現薔薇科李屬植物歐洲李中分離得到的黃酮類化合物蘆丁具有抗HCV 作用。研究表明，蘆?。?9）能夠抑制HCV-LP（丙型肝炎病毒樣顆粒）與肝癌細胞的結合，并抑制細胞培養來源的HCV（HCVcc）進入肝癌細胞。重要的是，蘆丁對肝癌細胞沒有毒性。此外，蘆丁可以直接作用于病毒顆粒來抑制HCV 生命周期的早期侵入階段。因此，蘆丁是一種用于治療HCV 感染的候選藥物。

從南美植物Pterogyne nitens 中分離得到了兩種具有抗HCV 作用的類黃酮化合物：對HCV 復制周期有影響的珍珠梅素（sorbifolin, 20）和胡麻黃素（pedalitin, 21）?；衔?0 和21 能夠在非細胞毒性條件下抑制病毒進入高達45.0%和78.7%。胡麻黃素通過對病毒顆粒的直接作用和干擾，阻止病毒進入宿主細胞。同樣，珍珠梅素也有抗HCV作用[16]。

從海綿真菌哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）中分離出兩個新型倍半萜烯的類似物：哈茲烷酸A（harzianoic acids A, 22）和B（harzianoic acids B,23）。 兩種化合物均顯示出降低HCV RNA 水平的抑制活性，且細胞毒性較低。哈茲烷酸A 的EC50=24.5 μmol/L，CC50=75.3 μmol/L；哈茲烷酸B 的EC50=20.4 μmol/L，CC50=74.3 μmol/L。作用機制表明，這些化合物可以阻斷HCV 生命周期的侵入，而病毒E1/E2 和宿主細胞CD81 是潛在的靶蛋白[17]。

3 未明確作用階段的抗HCV 天然產物

近年來，除了報道了一些已經初步明確了作用階段或機制的天然產物外，還報道了一些未明確階段和機制的化合物（圖3）。Li 等報道了從新疆紫草（Arnebia euchroma）分離得到的紫草素（24）顯示出較好的抗HCV 作用，其EC50= 0.025 μg/ml，CC50= 1.089 μg/ml，選擇指數（SI）= 43.56[18]。

Adianti 通過活性導向分離法從甘草中提取出的甘草香豆素（25）、甘草寧（26）、甘草酚（27）、甘草素（28）均具有較好抗HCV 活性，IC50分別為8.8、7.2、4.6 和16.4 mg/ml。但是，甘草的主要化學成分甘草酸以及甘草酸銨僅具有很弱的抗HCV活性。此外，甘草查耳酮A（licochalcone A）和光甘草定（glabridin）也顯示出較好抗HCV 活性，IC50分別為2.5 和6.2 mg/ml。另一個查耳酮異甘草素也顯示出抗HCV 活性，IC50為3.7 mg/ml[19]。

由黏桿菌Labilithrix luteola（DSM 27 648 T）分離而來的兩種新型次生代謝產物，labindole A [2-甲基-3-(2-硝基乙基)-3H-吲哚, 29]和labindole B [2-甲基-3-(2-硝基乙烯基)-3H-吲哚, 30]，以及已知的5 種代謝物經生物活性檢測發現：-氯-9H-咔唑（34）具有顯著的抗HCV 活性。9H-咔唑（33）和labindoles A（31）和B（32）都具有一定的HCV 抑制作用，其中4-羥甲基喹啉（35）活性較弱，并且均沒有細胞毒性[20]。

兩種新型的烏蘇烷型三萜皂苷bodiniosides O（36）和bodiniosides P（37）在體外均表現出一定的抗HCV 活性，選擇性指數分別為30.63 和9.08。在所測試的化合物中，化合物36 表現出一定抗HCV 活性，EC50值為0.41 nmol/L，CC50值為12.56 nmol/L，SI 值為30.63。此外，化合物37 也具有較好的抗HCV 活性，EC50值為1.58 nmol/L，CC50值為14.35 nmol/L，SI 值為9.08[21]。

圖3 具有抗HCV 作用的天然產物化學結構

從豆科槐屬植物苦豆子（Sophora alopecuroides）中提取的aloperine（38）是一種具有獨特的內環結構的喹喔啉生物堿。研究發現其具有一定的抗HCV 活性，最大有效濃度（EC50）為4.32 μmol/L，選擇指數（SI）為54.5[22]。

從sarcocornia 甲醇水提物中分離出一種新的黃酮醇三糖苷，鼠李糖3-O-2G-鼠李糖苷或鼠李糖苷3-O-（2″,6″-O-α-二鼠李糖基）-β-葡萄糖苷（39）。鼠李糖苷三糖苷被證實具有顯著的抗HCV 活性，IC50值為8.9 μmol/L[23]。

4 討論

綜上所述，近年來從天然產物中發現了大量的抗HCV 活性結構，結構類型主要包括黃酮、萜類、木質素等。這些活性天然產物可以干擾HCV 復制，抑制病毒入侵等，并且毒性較低。因此，從天然產物中尋找和發現的抗HCV 活性結構對于抗HCV 藥物的研究具有重要意義。