吉西他濱聯合卡鉑誘導NK/T細胞淋巴瘤細胞株凋亡的研究

阮濤，吳莉，劉岐煥，王季石

(1.貴州省人民醫院，貴州 貴陽 550002；2.湖北醫藥學院附屬東風醫院，湖北 十堰 442008；3.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550004)

NK/T細胞淋巴瘤(NKTL)是血液及淋巴系統的惡性腫瘤之一，是一種特殊且具有高度侵襲性的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，進展迅速且惡性程度極高[1]。在2016年WHO惡性淋巴瘤的分類標準中，NK/T細胞淋巴瘤被命名為結外NK/T細胞淋巴瘤(ENKTL)。目前研究顯示[2-3]，以門冬酰胺酶(L-ASP)為基礎的化療方案[如甲氨蝶呤+異環磷酰胺+左旋門冬酰胺酶+依托泊苷(SMILE)方案]用于進展期ENKTL患者效果較好，其近期療效以及遠期的生存率均優于傳統的環磷酰胺+多柔比星+長春新堿+潑尼松(CHOP)方案；含培門冬酶的方案[如吉西他濱+奧沙利鉑+培門冬酶(P-Gemox)方案]對于Ⅲ/Ⅳ期及難治復發的ENKTL療效較好，安全性較高[4]。也有報道[5-6]顯示，以吉西他濱(GEM)為基礎的方案，尤其是GDP(順鉑、吉西他濱、地塞米松)方案，患者耐受性可，能夠取得較好療效。2016年美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南[7]和2018年淋巴瘤診療規范中均推薦GDP方案作為晚期ENKTL的一線治療方案。GDP方案主要是吉西他濱、順鉑、地塞米松三種藥物組合的化療方案。吉西他濱為細胞周期特異性的脫氧胞苷類似物，作用在DNA的合成期(S期)；順鉑(DDP)為首個鉑類藥物，是一種廣譜且高效抗癌藥，但易造成一系列的毒性反應，其中腎毒性最為嚴重[8]?？ㄣK(CBP)為二代鉑類，其與順鉑均為細胞周期的非特異性藥物，非血液系統毒性(如耳、腎、神經毒性)較DDP低。目前國內外對卡鉑的研究不斷增加，在一些實體腫瘤中其抗腫瘤活性與順鉑相當，預測其在臨床化療中可能會有更大的空間[9-11]。目前吉西他濱聯合卡鉑用于治療ENKTL的研究未見類似報道，因此本實驗以卡鉑替換順鉑，旨在探討吉西他濱聯合卡鉑對ENKTL細胞株SNK 6細胞增殖的影響及可能的作用機制，為尋找低毒、高效的ENKTL化療方案提供一定的實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

NK/T細胞淋巴瘤細胞株(SNK 6)為本課題組長期保存；吉西他濱購于豪森藥業有限公司，卡鉑、順鉑購于齊魯制藥科技公司；RPMI1640細胞培養基、胎牛血清購于Hyclone公司，二甲基亞砜(DMSO)購于北京索寶萊公司；細胞增殖-毒性檢測法(CCK-8)試劑盒購于日本同仁研究所；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購于碧云天生物技術研究所；BCA蛋白定量、PVDF膜試劑購于碧云天生物技術研究所；一抗[甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，Cleaved-Caspase-3、B細胞淋巴瘤-2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)]和二抗(羊抗兔)購于CST公司。

1.2 細胞培養

從液氮瓶中快速取出實驗用的細胞(SNK 6細胞)，將細胞重懸并接種到25 mL培養瓶中，輕輕搖勻后轉入5% CO2，37 ℃，濕度為95%的細胞培養箱中進行培養，使細胞均勻貼壁生長，隔天進行細胞換液，使用磷酸緩沖液(PBS)洗滌2 次。取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 實驗分組

選取吉西他濱分別與卡鉑和順鉑做聯合實驗，用金式公式計算其聯合用藥的Q值。金式公式：Q=Ea+b/(Ea+Eb-EaEb)。公式中的Ea為A藥單用的抑制率，Eb為B藥單用的抑制率，Ea+b為兩藥聯合應用的抑制率。Q值>1.15表示兩藥聯合具有協同作用，Q值為0.85～1.15提示兩藥聯合具有相加作用，Q<0.85提示兩藥聯合具有拮抗作用。按試驗需求設置分組：空白對照組、吉西他濱組、吉西他濱+卡鉑組、吉西他濱+順鉑組。采用流式細胞術和蛋白免疫印跡法(Western Bloting)檢測細胞凋亡率與凋亡蛋白表達。

1.4 CCK-8法檢測藥物對SNK 6細胞增殖的影響

用移液器輕柔吹打收集的處于對數期的SNK 6細胞，制成單細胞懸液，調整濃度為5×103個/mL，以每孔100 μL懸液接種于96孔板，設5個復孔，按設定的藥物濃度處理細胞，于培養箱中分別孵育48 h；培養結束后向各孔再輕柔加入10 μL CCK-8溶液，轉入培養箱中再孵育4 h；而后采用酶標儀(450 nm)檢測各孔的吸光度(OD值)，重復3次。根據OD值計算細胞抑制率，公式為：抑制率=(1-加藥孔OD值/對照孔OD值)×100%。應用SPSS軟件算出半數抑制濃度(IC50)。采用金氏公式判斷吉西他濱與卡鉑組和吉西他濱與順鉑組聯合用藥的性質。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測凋亡率

采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術(FCM)檢測凋亡率。收集對數期生長的SNK 6細胞，于96孔板中緩慢加入細胞懸液，每孔2 mL，加入上述4組藥物，轉入培養箱中孵育48 h后收集細胞，離心5 min后倒去上層清液；用PBS洗滌SNK 6細胞2次，再次離心后棄掉上層液體收集沉淀；以1×Binding Buffer重懸細胞。分別向上述4組細胞懸液中逐滴緩慢加入5 μL Annexin V-FITC染液，冰上避光孵育15 min后，加10 μL碘化丙啶染色液(PI)混勻，避光且于4 ℃下孵育5 min；最后加400 μL 1×Binding Buffer；在60 min內用流式細胞儀檢測。

1.6 蛋白免疫印跡法檢測凋亡蛋白的表達

提取各組細胞的蛋白，通過電泳、轉膜、洗膜、一抗4 ℃搖床孵育16 h、二抗室溫孵育1 h、洗膜、在蛋白免疫印跡化學發光試劑盒(ECL)液中于凝膠成像系統下曝光，以GAPDH為內參照。

1.7 統計學方法

2 結 果

2.1 三種藥物單用對SNK 6細胞增殖的影響

根據藥物終濃度(即藥物在體內血漿峰濃度的1/10)的不同比例以及預實驗(藥物敏感實驗)的結果來設定吉西他濱、卡鉑、順鉑三種藥物的不同濃度梯度，采用CCK-8法分別檢測上述三種藥物對SNK 6細胞的抑制作用，用細胞抑制率與劑量對數作圖，并求出各自IC50值。結果提示：與空白對照組比較，不同濃度的吉西他濱、卡鉑、順鉑作用于培養48 h的SNK 6細胞均有抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，對SNK 6細胞的抑制作用也逐漸增強，呈劑量依賴效應，差異均有統計學意義(P<0.05)。吉西他濱、卡鉑和順鉑的IC50分別為(0.001 7±0.000 3) μg/mL，(10.44±1.23) μg/mL，(5.75±0.51) μg/mL(見表1和圖1)。

表1 不同濃度藥物單用對SNK 6細胞的抑制率

圖1 吉西他濱和卡鉑及順鉑對SNK 6細胞的抑制率

2.2 吉西他濱聯合卡鉑或順鉑對SNK 6細胞增殖的影響

根據2.1結果，用不同濃度吉西他濱分別與順鉑和卡鉑做聯合實驗，即0.000 1 μg/mL吉西他濱+5.75 μg/mL順鉑或10.44 μg/mL卡鉑，以及0.001 7 μg/mL吉西他濱+5.75 μg/mL順鉑或10.44 μg/mL卡鉑，通過計算出Q值判斷吉西他濱與卡鉑和吉西他濱與順鉑聯合用藥的性質。結果顯示，在較低濃度吉西他濱(0.000 1 μg/mL)與卡鉑和順鉑的聯合用藥中，吉西他濱+卡鉑組和吉西他濱+順鉑組對SNK 6細胞的抑制率與吉西他濱相比明顯增高(P<0.05)，兩者聯合為相加作用。吉西他濱+卡鉑組對細胞的抑制率略低于吉西他濱+順鉑組，但差異無統計學意義(P>0.05)，說明其對SNK 6細胞抑制率相當，且兩藥聯合仍為相加作用(見表2)。

2.3 吉西他濱聯合卡鉑或順鉑對SNK 6細胞凋亡的影響

2.3.1 細胞凋亡率檢測

根據以上實驗提示吉西他濱聯合卡鉑對SNK 6細胞有抑制作用，吉西他濱+卡鉑與吉西他濱+順鉑對SNK 6細胞抑制作用相當，進一步檢測其對SNK 6細胞凋亡的影響，結果顯示：空白對照組、吉西他濱組、吉西他濱+卡鉑組、吉西他濱+順鉑組凋亡率依次為：(4.39±1.06)%，(24.30±2.64)%，(47.11±1.98)%和(51.41±2.15)%。吉西他濱組細胞凋亡率明顯高于空白對照組(P<0.05)，吉西他濱+卡鉑組、吉西他濱+順鉑組均高于吉西他濱組和空白對照組(P<0.05)，而吉西他濱+卡鉑組細胞凋亡率稍低于吉西他濱+順鉑組，但兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)(見圖2)。

a為空白對照組；b為吉西他濱組；c為吉西他濱+卡鉑組；d為吉西他濱+順鉑組；e為四組的凋亡率比較；*表示吉西他濱組和吉西他濱+卡鉑組與空白對照組相比，P<0.05圖2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡

2.3.2 凋亡相關蛋白檢測結果

為了進一步探索吉西他濱聯合卡鉑誘導SNK 6細胞凋亡的可能機制，用Western Blotting法檢測上述四組Cleaved-caspase-3，Bcl-2，Bax等凋亡蛋白的表達水平。結果顯示：與空白對照組相比，吉西他濱可下調Bcl-2蛋白的表達水平，上調Cleaved-caspase-3蛋白、Bax蛋白的表達水平(P<0.05)。與吉西他濱組比較，吉西他濱與卡鉑或順鉑聯合時效果更加顯著(P<0.05)，吉西他濱+順鉑組效果稍強于吉西他濱+卡鉑組，但差異無統計學意義(P>0.05)(見圖3)。

3 討 論

ENKTL有其獨特的生物學及臨床表現，Ⅰ期/Ⅱ期ENKTL患者可考慮放療或化療聯合治療，Ⅲ/Ⅳ期可采用以L-ASP為基礎的化療和造血干細胞移植。目前GDP方案被推薦為治療晚期ENKTL的一線方案?？ㄣK腎毒性較順鉑低，可替換順鉑用于許多癌癥的化療，但卡鉑并不是在所有腫瘤中都具有類似順鉑的效應。目前吉西他濱聯合卡鉑用于治療ENKTL的研究未見類似報道。因此，本實驗以卡鉑替換順鉑，采用CCK-8法、流式細胞術、Western Blotting法來探討卡鉑聯合吉西他濱對SNK 6細胞的凋亡作用。本實驗結果顯示，隨著藥物濃度的不斷增加，對SNK 6細胞的抑制率不斷增強，有明顯的劑量依賴效應。吉西他濱對SNK 6細胞抑制作用最強，與國外報道相一致[12-13]。本實驗卡鉑對SNK 6細胞的抑制作用低于順鉑?；仡櫺匝芯縖14]表明，卡鉑是不依賴耐藥基因MDR-1的藥物，對ENKTL有較好的效果，而在本研究中，卡鉑單用對SNK 6細胞抑制效果低于順鉑，這可能與惡性腫瘤細胞在體內外生長存在特異性差異有關系。同時，卡鉑以聯羧基環丁烷取代順鉑結構中的氯離子配體，與DNA交聯作用較為緩慢，是導致其藥理作用和毒副作用差異的關鍵因素[15]。

#表示吉西他濱組與空白對照組相比，P<0.05；*表示吉西他濱+卡鉑組和吉西他濱+順鉑組與吉西他濱組相比，P<0.05圖3 Western Blotting檢測各組凋亡相關蛋白相對表達結果

本研究結果顯示，吉西他濱+卡鉑組對細胞的抑制率略低于吉西他濱+順鉑組，但差異無統計學意義。在本實驗聯合用藥中，卡鉑、順鉑分別與吉西他濱聯合，發現其對SNK 6細胞的抑制作用相當，這可能與吉西他濱和卡鉑聯合應用時具有相加作用有關。有報道顯示[16]吉西他濱可通過促進DNA合成以及修復來加強卡鉑的細胞毒性；卡鉑同時能提高吉西他濱導致DNA鏈變性的作用，提示二者聯合可以增強藥物的療效。同時有研究[17-19]顯示，吉西他濱聯合卡鉑用于治療宮頸癌、尿路上皮癌、非小細胞肺癌均有一定效果，但二者聯合治療ENKTL卻未見類似報道。本實驗采用Annexin V-FITC/PI流式細胞術來檢測凋亡率，其結果提示：吉西他濱聯合卡鉑或順鉑的凋亡率均高于吉西他濱組和空白對照組，而吉西他濱+卡鉑組細胞凋亡率稍低于吉西他濱+順鉑組，但兩組比較差異無統計學意義。該結果與CCK 8法結果一致，提示卡鉑聯合吉西他濱可誘導SNK 6細胞凋亡，且卡鉑、順鉑分別與吉西他濱聯合時對SNK 6細胞凋亡作用相當。有研究顯示，吉西他濱可有效促進與Cleaved-Caspase-3相關的凋亡通路的激活，對特定蛋白底物水解進行有效抑制，從而誘導細胞凋亡[20]。本實驗Western Blot結果提示：與空白對照組相比，吉西他濱通過下調Bcl-2蛋白的表達，上調Bax蛋白的表達，使Bax/Bc1-2升高，從而上調cleaved caspase-3蛋白的表達。吉西他濱與卡鉑和順鉑聯合時蛋白表達趨勢更為顯著，且吉西他濱+卡鉑組稍低于吉西他濱+順鉑組，兩組比較差異無統計學意義，從而推測吉西他濱、卡鉑可能是通過線粒體途徑促進SNK 6細胞發生凋亡。但細胞凋亡過程較為復雜，凋亡基因之間復雜的調控關系有待利用其他方法進一步研究。

綜上，吉西他濱聯合卡鉑可誘導SNK 6細胞發生凋亡，其可能機制是通過線粒體途徑發生凋亡，且一定濃度下的卡鉑或順鉑聯合吉西他濱對SNK 6增殖及凋亡作用相當。本實驗提示：吉西他濱聯合卡鉑在一定濃度條件下或許可以替換吉西他濱聯合順鉑用于ENKTL的化療，尤其在因順鉑的腎毒性嚴重而無法使用順鉑時，卡鉑與吉西他濱聯用可能更具優勢。但本實驗不足之處在于細胞在體外培養的環境與腫瘤細胞的體內生長環境不完全相同，藥物敏感實驗僅反映部分腫瘤細胞的凋亡率，只能反映腫瘤生長的某一個階段，并不能完全體現藥物-人體-腫瘤的關系，有待后續進行相應的動物實驗及臨床實驗深入探討。