豫南地區野生大豆種質資源的SSR遺傳多樣性分析

劉紅云， 周 強， 李淑梅， 王付娟

(信陽農林學院農學院/河南省豫南農作物有害生物綠色防控院士工作站， 河南 信陽 464000)

野生大豆(Glycinesoja)屬豆科(Leguminoase)蝶形花亞科(Papilionoideae)大豆屬(Glycine) Soja 亞屬[1]，屬于一年生草本植物，它的種子及根、莖、葉均可入藥。主要分布在東亞中北地區，包括中國、朝鮮半島、日本列島和俄羅斯遠東地區。在我國，除了青海、新疆和海南外，其余省份均發現有野生大豆的分布[2]。熊振宇等[3]用20對ISSR引物對野生大豆與栽培大豆及其10份雜種F1進行遺傳多樣性分析，探討野生大豆與栽培大豆之間的遺傳關系。對野生大豆的遺傳多樣性研究，最早的是形態學、同位酶標記，李軍等[4]利用聚丙烯酰胺電泳技術檢測了浙江金華南坡野生大豆種群內14個樣本6種同工酶水平上的生化遺傳結構及其變異。李為民等[5]為了研究陜西省不同居群野生大豆的遺傳多樣性，歸納了幾種常見DNA分子標記技術的原理及特點，綜述了不同DNA分子標記在野生大豆遺傳多樣性研究中的應用現狀。

SSR分子標記技術重復性高、簡單可靠，應用于研究各種作物的遺傳結構和遺傳多樣性。嚴茂粉等[6]利用40對SSR引物對北京地區的野生大豆天然居群進行了遺傳結構和遺傳多樣性分析。李為民等[7]利用SSR分子標記對陜西省6個野生大豆自然種群和1個栽培大豆種群的遺傳多樣性和遺傳結構進行了分析。王果等[8]以山西省的544份野生大豆為材料，分析了質量性狀、數量性狀及SSR標記遺傳多樣性。但對河南省野生大豆遺傳多樣性研究比較少見，尤其是河南省豫南地區的野生大豆。因此，對河南豫南地區12份野生大豆材料進行SSR遺傳多樣性分析，旨在分析河南省豫南地區野生大豆資源的遺傳多樣性分布特點，揭示豫南地區野生大豆的親緣關系，為河南省野生大豆種質資源的利用與開發提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

12份野生大豆材料，于2019年10—11月分別在河南省信陽市平橋區、駐馬店市正陽縣、南陽市桐柏縣3個地點采集，其中信陽市5份、駐馬店市1份、南陽市6份。

1.2 器 材

研缽和研磨棒、1.5 mL離心管、植物組織基因組提取試劑盒、PCR儀、離心機、垂直板電泳槽、水平電泳儀、照膠儀、微波爐、水浴鍋。

1.3 試 劑

液氮、200 μL RCP tube、DNase-free water、2×Taq酶Mix、20對引物濃度為10 μmol·L-1、瓊脂糖、1%TBE、GelRed、EDTA。

1.4 方 法

1.4.1DNA提取

采用CTAB法，取泡水發芽的大豆組織(時間2～3周，2～3 cm)100 mg，置于液氮中在研缽里進行研磨液體狀，快速盛入1.5 mL離心管中，編號，置于-20 ℃冰箱中保存，使用植物組織基因組提取試劑盒對研磨的樣本進行基因組抽提；最終洗脫體積為100 μL；使用Nanodrop測定樣本DNA濃度，將測定濃度后的DNA樣品放置在4 ℃冰箱臨時保存。

1.4.2SSR標記

PCR的反應體系為：DNA模板4.5 μL(10 μg·L-1)，2×Taq酶 PCR Mix 10 μL，10 μmol·L-1正反引物各1.5 μL，加無菌水至20 μL。反應程序為95 ℃下預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃循環60 s，循環35次，72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存。

表1 12份樣本DNA濃度Table 1 DNA concentration of 12 soybean samples

1.4.3瓊脂糖凝膠電泳檢測

用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，120 V電壓條件下30～40 min電泳，待電泳結束后在照膠儀器上拍照保存膠圖。

1.5 數據分析

對跑過的膠圖條帶進行統計。使用Photoshop軟件對膠圖進行修正處理，處理完后再用分析軟件Quality one對圖片進行分析，對擴增后的每個樣品的片段大小進行確定，確定每個樣品的位點和條帶數。然后根據每個引物在各樣品上顯示的位點進行統計帶數，有條帶的標為1，無條帶的標為0，將數據輸入軟件Excel中，創建矩陣，用Popgene 32軟件進行遺傳相似系數分析，然后根據遺傳相似系數用Ntsys 1.0軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 SSR位點多態性分析

利用20對引物對豫南地區12份野生大豆基因組進行擴增，如表2所示，20對引物總共擴增了360條帶，擴增帶數最多的為42條(Satt 654)，如圖1所示；擴增帶數最少的為8條(Satt 022)。20個位點共檢測到63個等位基因變異，平均每個位點擴增3.1個等位基因。結果如圖2所示，并且20對SSR引物都表現出多態性，等位變異有隨著取樣范圍的縮小逐漸減少的趨勢。

表2 20對引物擴增的結果Table 2 Amplification results of 20 pairs of primers

2.2 野生大豆的遺傳相似性分析

12份野生大豆的遺傳相似性如表3，每份材料的遺傳相似性變化范圍為0.590 9～0.954 5，平均為0.797 1，其中，XY 2與XY 4的遺傳相似性最高，為0.954 5，說明XY 2與XY 4的親緣關系較近；TB 2與TB 3的遺傳相似性最低，為0.590 9，說明TB 2與TB 3親緣關系較遠，雖然地理位置相同，但親緣關系不同，可能是種群間出現了變異。

表3 12份材料的遺傳相似系數Table 3 Genetic similarity coefficient of 12 soybean materials

2.3 野生大豆的聚類分析

根據遺傳相似系數建立的12份材料的樹狀聚類圖(圖3)。根據聚類圖，可以將這些材料分三大類。第一大類包括10份，分別為TB 6、TB 5、TB 4、XY 5、XY 3、XY 2、XY 4、ZY、XY 1、TB 1，又可分為2個亞類；第1亞類包括2份，分別為TB 6、TB 5；第2亞類包括8份，分別是TB 4、XY 5、XY 3、XY 2、XY 4、ZY、XY 1、TB 1。第二大類1份TB 3；第三大類1份TB 2。12份材料的遺傳距離都小于0.12，說明材料之間有較近的親緣關系。從聚類結果可以看出，SSR分子標記與材料的地理來源并沒有明顯的相關性。

3 討 論

李建東等[9]利用40對引物對遼寧省30份野生大豆進行多樣性分析，結果表明，中部平原遺傳多樣性指數最高，其次為東部山地，西部丘陵最低，從聚類結果看到SSR分子標記的結果與品種的地理來源沒有相關性。本研究對12份材料聚類分析，聚類結果分為三大類，三大類又分為2個亞類，從聚類結果看到，SSR分子標記與材料的地理來源并沒有明顯的相關性。有可能是材料的地理距離太近，環境因素相似。

利用SSR分子標記野生大豆種質資源多樣性分析，得出12份野生大豆在分子水平上發生了一定的遺傳變化，野生大豆親緣關系與材料生長的地理環境、表型性狀等具有一定的相關性，同一區域收集到的野生大豆也表現出遺傳分化。與程春明等[10]對江西野生大豆的遺傳多樣性分析的結論一致。進一步了解豫南地區野生大豆種質資源的遺傳規律及進化，也進一步為野生大豆雜交育種及生理栽培研究等提供指導。由此可見，在豫南地區，積極發掘野生大豆，分析和研究利用其特性，拓寬大豆育種遺傳基礎是十分必要的。

4 結 論

本研究利用20對引物對12份野生大豆材料進行遺傳多樣性研究，結果表明，20對引物對12份野生大豆共擴增63個等位基因，平均每對引物擴增3.1個等位基因。說明豫南地區具有較高的的遺傳多樣性，并且該地區屬于亞熱帶季風氣候，有利于喜溫作物生長?；?0對SSR引物PCR結果的聚類分析能將12份材料分類出來，得知各材料之間親緣關系較近，SSR分子標記與材料的地理來源并沒有明顯的相關性，進而證實SSR標記在遺傳多樣性分析中有很高的準確性。由于當時只是在豫南地區選擇3個點進行收集野生大豆，一些野生大豆資源豐富的鄉鎮可能收集不夠全面，只有部分野生大豆的多樣性，結論僅供參考。今后將擴大收集野生大豆的地區，豐富野生大豆的資源，有針對性地進行研究，拓寬大豆育種的遺傳基礎。