微生物鑒定技術在無菌藥品生產中的應用

＊王元紅

（山東魯抗醫藥股份有限公司 山東 272021）

現階段，我國的藥品安全問題已經成為了當下社會最為關注的話題之一。2006年的“欣弗事件”，讓我國進入了持續數年的藥品微生物污染的高發期，大眾對于藥品安全愈加重視，無菌藥品生產行業對于微生物鑒定技術的要求也在逐年提升。無菌藥品已經屬于高風險藥品生產領域，尤其是隨著2010年出臺的《藥品生產質量管理規范》以及《中華人民共和國藥典》的實施，極大的提升了對無菌藥品生產的要求。目前，國內多數的無菌藥品審查和企業已經具備了GMP對于無菌藥品生產的條件，無論是在硬件還是軟件方面都有極大的提升。但不可否認，在無菌藥品生產中，有關微生物鑒定技術還是有待加強，也并未建立完善的管理體系。從根本來看，微生物對于藥品的質量和安全至關重要，尤其是對于臨床當中免疫力低下人群的影響更大?；诖?，無菌藥品生產的過程中，務必要加強對于微生物鑒定技術的應用，以此提升無菌藥品的藥效。

1.無菌藥品生產行業中應用微生物堅定技術的作用分析

因許多方面都會對藥品衛生檢測產生影響，因此，在進行藥品生產時，微生物檢測結果的準確度就顯得尤為重要，同時還必須對微生物檢測的技術進行優化和提升。尤其是在近些年，我國因藥品安全引發的事故屢見不鮮，針對無菌藥品的微生物檢測是其保障產品安全的重要途徑，微生物鑒定技術的優化可以助力無菌藥品安全，使其檢測的結果也更具可靠性。如今，微生物檢測技術已經成為了無菌藥品的重要安全保障，同時也為無菌藥品的生產奠定了良好的基礎。

2.無菌藥品生產領域主要應用的微生物鑒定技術分析

2010年出臺的GMP（良好操作規范）對食品、藥品等生產企業提出了更高的要求，尤其是無菌藥品從其生產加工開始，一直到倉儲運輸，都要確保藥品的安全衛生，微生物作為對無菌藥品影響最重要的因素，從其藥物原料、輔料到最終的無菌藥品以及生產環境都要進行微生物鑒定。無菌藥品的整個生產流程都務必要對微生物進行適當的控制，一旦微生物出現控制不當的情況，無菌藥品的質量必然會受到影響，這一結果不僅會為生產無菌藥品的企業帶來巨大的經濟損失，還會對群體的生命安全造成威脅。因此，我們對于微生物鑒別首先就要清楚微生物風險的識別和控制。

(1)在無菌藥品生產中應用的PCR技術研究

PCR技術是指利用體外酶的催化作用促進對特異性DNA片段的合成，PCR技術采用擴增產物的方式，使得DNA數量驟增，以其從原有數量的基礎上增長百倍，之后便利用熒光條進行檢測，這種方式對微生物種類進行鑒定極為便捷，從實際的角度而言，在其檢測工作的過程中，PCR技術極為成熟，具有超強的靈敏性。而從理論的角度來看，在進行細菌檢測的過程中，細菌的拷貝基因可以通過PCR的技術進行檢測，此后便可以增菌，增菌的時間是受到一定限制的，這樣檢測技術的應用，便可以在極大的程度上節省檢測的時間。

(2)無菌藥品生產應用的基因芯片技術

基因芯片是指采用當前先進的科學技術和微加工技術，對基因的寡核酸苷酸進行排序，其排序的載體是硅片等物質，最終要達成的結果是要形成高密度的排序形式，而這也被稱之為信息檢測芯片。

在無菌藥品生產領域中，其主要的應用技術為兩個，其一是基因芯片，即信息檢測芯片。其二是微生物檢測技術，主要采用熒光標記技術融合而成，微生物檢測技術主要是通過基因探針、寡核苷酸點之間的雜交情況來進行分析，將這二者的雜交情況進行掃描，來了解熒光的分布情況，最終是要判斷出，檢測樣品當中是否存在微生物這一問題。

基因芯片技術想要擴大其檢測的范圍，可以采用增長探針的方式以此達到目的。而探針技術的不斷升級和優化，不僅可以擴大其檢測的范圍，還能提高芯片檢測的效果?；驒z測技術可以應用的領域十分廣泛，而針對無菌樣品生產的檢測，甚至可以細化到對試驗檢測中的致病源進行全面的檢測。和傳統的基因檢測技術相比，現階段基因檢測技術仍舊在不斷的優化和升級，其自動化的程度也得到了大大的提升，而且在優化的過程中，基因檢測技術的操作也不斷簡化，不再像傳統基因檢測技術那般復雜，其準確性也得到了提升。

(3)無菌藥品生產中應用的基因探針技術

基因探針檢測技術利用核苷酸序列對生物素等進行標記的特性，以此通過與生物特定基因結構進行結合，并將基因、蛋白質結構標記出來，以達到方便檢測的目的。其原理并不復雜，主要是通過對熒光標記的核苷酸，采用分子雜交的方法，使得二者進行結合特定生物素并攜帶標記信號，再對這一標記信號進行檢測。

通常情況下會針對同位素進行檢測，但探針的標記特定性極為鮮明，同時還是提升微生物檢測準確性的重要路徑，除此之外，基因探針檢測技術還能極大的提升檢測的速度，但因在檢測的過程中，已經被標記的同位素具有一定的污染性，所以當我們在進行基因探針檢測時一定要做好防護措施，在檢測的過程中，還要注意操作的規范性，避免隨意處理檢測廢棄物而造成惡劣的影響。

(4)基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜的應用

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜，簡稱MALDITOFMS。簡單來說MALDI-TOFMS是一項菌種鑒定技術，其鑒定主要基于微生物核糖體和外周蛋白特異性及保守性。菌體蛋白與基質結晶，想要進行離子化，需要先進行吸光，當離子化后，會形成不同的離子峰，主要原因在于真空電場的質荷比不同，在離子化后進行分離而形成了不同離子峰，最終的結果是形成了蛋白指紋圖譜。

MALDI-TOFMS具有極快的檢測速度，在一次的檢測當中，可以進樣96宗，大樣本篩查可以使用384孔板，檢測結果在3min之內就可以得出。而且其靈敏性也極高，可以識別0.1μL的菌液，針對不同的菌株進行鑒定優勢也極為明顯，尤其是苛養菌、厭氧菌等一類。再加上MALDI-TOFMS的準確率較高，可以達到95%以上。

但MALDI-TOFMS也并非在任何鑒定中具有優勢，它也存在一定的局限性。尤其是對于絲狀真菌的鑒定準確率并不高。究其原因，因絲狀真菌的菌體破壁并不完全，想要將菌體蛋白提取出來具有較高的難度。而隨著研究的不斷推進，想要解決絲狀真菌蛋白提取的問題，我們發現，SDB即沙氏葡萄糖液體培養基在進行旋轉培養、使用研磨-超聲裂解提取法提取之前進行處理可以很好地解決這一難題，最終鑒定的準確率得到了提升。個別時候，MALDI-TOFMS也會對菌體進行誤判，較為常見是將志賀菌認為成大腸埃希菌，這兩個菌體在遺傳背景上具有較強的相似性，而且他們的DNA序列的相關性也極高，還具有相似的菌體蛋白特征峰。其數據庫有關志賀菌屬相關內容缺失，可以使用生理生化和血清學進行實驗，并對其結果進行判斷。

(5)16SrRNA基因測序的應用

16SrRNA為核糖體RNA的一個亞基，其存在于兩個區，其一是保守區，主要反應親緣關系，其二是可變區，體現的是生物物種間的特異性。而16SrRNA基因對微生物進行鑒定，主要是根據遺傳物質和分子水平，這一鑒定技術獲得了業內的極大認可。

16SrRNA的保守性有其優勢的一面，但同時也呈現出一大弊端，那就是異種同源性。有些不同種的微生物的16SrRNA序列幾近相同，而想要解決這一問題，可以通過16SrRNA/ITS基因序列分析來完成。而ITS即內部轉錄間隔區是位于rRNA基因之間的非功能性片段，而這一非功能性片段的進化壓力并不大，其變異性較強，即便極為接近的菌種，也可以在ITS序列上呈現出一定的差異性。

針對親緣接近的微生物鑒定，大部分采用的是16SrRNA/ITS基因測序方法，主要是因其在這一方面具有較強的優越性，再通過HTS即高通量測序技術，不僅可以對痕量菌低豐度物種進行檢測，其檢測的效率和準確定都極高。

(6)VITEK2Compact系統的應用

VITEK2Compact即全自動微生物鑒定系統，其基礎是微生物的升華反應，同時與比色、比濁動態分析技術相結合，并對其進行自動化鑒定。當我們在使用VITEK2Compact時，需要挑取單個菌落，將其與一定濃度的菌懸液進行配置，再根據菌落形態和革蘭氏染色結果，接種到對應的鑒定卡上，對其進行分析，最后要對鑒定卡內的各孔培養基的生長變化值進行讀取，最終對菌株的種屬進行最終的確定。

鑒定卡孔共計64個，適用范圍廣泛，即便是在同一時間也可進行多項生理生化試驗，一般性的試驗結果大概在6-8h獲得，而酵母菌試驗結果時間較長，大約在18h左右。從中也可看出，VITEK2Compact優勢極為明顯，不僅操作簡單，耗費時間還相對較短。

因VITEK2Compact的主要判定依據，是菌種的生理生化特性，而因菌種的特殊性，其生長的情況對鑒定的結果具有一定的影響。菌種儲存應該多加注意，尤其是在穩定和儲存時間方面更應留心。因為一些菌種的保存時間越長，其鑒定結果的符合率越低，而保存時間較短，其堅定結果符合率越高，也就是說部分菌種鑒定結果符合率與其儲存時間呈負相關?；诖?，在對菌種進行鑒定時，最好是能夠使用新鮮的菌種，以便保證其鑒定結果的符合率較高。除此之外，生化反應對于菌液濃度也有所要求，因此，在進行生化反應為基礎的鑒定時，盡可能的將生長緩慢、培養困難的細菌刨除在外。

3.結語

總而言之，無菌藥品的微生物檢測對其產品質量起到了至關重要的影響。因此，我們需要對微生物堅定技術持續研發，不斷將其升級換代，同時也要將其安全作用在無菌藥品的生產流程中呈現出來，以確保無菌藥品生產的效率和質量。