基于UPLC-MS/MS技術對藍莓中花青苷類物質的定性定量分析

魏海蓉，易錫斌，譚鉞，徐麗，宗曉娟，朱東姿，劉慶忠，王甲威，張力思

（1.山東省果樹研究所/山東省果樹生物技術育種重點實驗室，山東 泰安 271000；2.濟南磐升生物技術有限公司，山東 濟南 250102）

藍莓屬于杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium）的一種漿果類果樹，富含花青苷、熊果酸、黃酮等抗氧化物質，具有改善視力、增強記憶力、軟化血管、抗癌等多種保健功能，倍受消費者的青睞［1，2］。藍莓果實富含的花青苷是一大類非常重要的功能性成分，隨著對其生物學活性功能研究的不斷深入，藍莓花青苷越來越多地被開發應用于食品、藥品和化妝品領域，具有廣闊的發展前景。

花青苷是一種廣泛存在于植物體中的水溶性天然色素，屬于一類具有多個酚羥基的天然黃酮類化合物，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗腫瘤、調節免疫、改善血液循環和預防心血管疾病等多種生物活性［3-5］?；ㄇ嘬盏幕瘜W結構決定其生物學功能，不同種類花青苷因與花青素結合的糖基種類、位置和數量不同，結構存在差異，具有不同的生物學活性。因此，研究藍莓果實花青苷類物質的組成和含量，對綜合開發藍莓相關產品具有重要意義。

目前人們對花青苷代謝途徑及調控機理的研究較為深入，但是對其發揮生理功能活性所涉及的分子結構及花青素的修飾、轉運過程等方面還比較少［6，7］。目前常用的花青苷檢測方法主要有紫外可見分光光度法、液相色譜法和液相色譜串聯質譜法［8-10］。其中，高效液相色譜串聯質譜法在快速分離、準確定性和靈敏度等方面較前兩者更具有優勢。本研究以超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜（UPLC-MS/MS）技術對3個藍莓品種成熟果實中花青苷組分的種類和含量進行比較分析，旨在為藍莓優異種質挖掘和藍莓花青苷產品的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

本試驗所用高灌藍莓品種‘藍豐’（Vaccinium corymbosum‘Bluecrop’）和‘喜來’（V.corymbosum‘Sierra’）以及兔眼藍莓品種‘藍冠’（Vaccinium ashei Read‘Lan Guan’）的成熟果實均采自山東省果樹研究所試驗基地。從健株上隨機選取無病蟲害、無機械損傷、充分發育成熟的果實，切碎，液氮速凍，存于-80℃冰箱，用于測定。

乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純?；ㄇ嘬諛藴饰镔|包括飛燕草素-3-半乳糖苷、錦葵素-3-阿拉伯糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、牽?；ㄋ?3-葡萄糖苷、牽?；ㄋ?3-半乳糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷、芍藥素-3-蕓香糖苷、芍藥素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷。

1.2 儀器與設備

Triple Quad 4500液相色譜-三重四極桿串聯質譜聯用儀；超純水儀；Phenomenex kinetex C18色譜柱；旋轉蒸發儀；TH-100BQX型數控超聲波清洗機。

1.3 花青苷提取

取鮮樣0.5 g，加液氮研磨，轉入50 mL離心管中，加入甲醇-0.1%甲酸（2∶8，V/V）提取液15 mL，室溫下超聲波提取10 min，然后置于4℃條件下浸提24 h，再4℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液，35℃旋轉蒸干，用甲醇-0.1%甲酸水溶液回溶，并定容至2 mL。采用0.22μm有機微孔濾膜過濾后裝入2 mL進樣瓶，待上機測定。

1.4 色譜與質譜條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱Phenomenex Kinetex（100 mm×4.6 mm，2.6μm），流動相A 0.1%甲酸水溶液，流動相B乙腈，進樣量5μL，流速1.0 mL/min，柱溫35℃。采用梯度洗脫：0～1.0 min，5% B；1.0～2.5 min，5% ～50% B；2.5～3.8 min，50%～70% B；3.8～5.0 min，70%～90% B；5.0～6.0 min，90% B；6.0～6.2 min，90% ～5%B；6.2～8.0 min，5% B。

1.4.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式；多重反應監測（MRM）參數：氣簾氣241.325 kPa，離子源電壓5 500.00 V，離子源溫度550.00℃，離子源電離反應氣體379.225 kPa，脫溶劑氣體379.225 kPa，碰撞池氣體48.265 kPa。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

花青苷類物質在C18色譜柱上能夠得到很好的分離［11，12］。因此本試驗選用Phenomenex Kinetex C18（100 mm×4.6 mm，2.6μm）色譜柱，根據花青苷類物質結構復雜、酸性條件下較為穩定、極性較強且差異較小的特性，對流動相組成、流速、梯度洗脫程序進行優化。確定流動相A采用弱酸性的0.1%甲酸水溶液，流動相B采用乙腈，進樣量5μL，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，梯度洗脫。在此條件下能夠較好地分離和檢測出11種化合物?？傠x子流圖見圖1。

圖1 花青苷類物質的總離子流圖

2.2 質譜參數優化

在電噴霧正離子模式下對化合物標準溶液進行母離子Q1掃描。飛燕草素-3-半乳糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷、錦葵素-3-半乳糖苷、芍藥素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-蕓香糖苷、牽?；ㄋ?3-半乳糖苷、錦葵素-3-阿拉伯糖苷、牽?；ㄋ?3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷11種化合物的母離子均以［M+H］+或［M］+形式存在。確定母離子后，再對母離子進行二級質譜掃描。通過對二級質譜參數如錐孔電壓、碰撞能量等進行優化，確定每種物質選擇3個信號較強子離子與母離子組成檢測離子對，采用MRM檢測模式對待測物進行定性和定量檢測。試驗表明，DP電壓35～90 V時Q1豐度幾乎不變；DP較高時異構體的豐度有所差異，為了不影響異構體的豐度，選擇40 V作為最終DP電壓，碰撞池入口電壓（EP）、出口電壓（CXP）分別為12、9 V。11種花青苷在色譜柱上的相對保留時間、定性離子對及質譜參數見表1。

表1 MRM監測模式下11種花青苷類物質的保留時間及定性離子對參數

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

采用甲醇-0.1%甲酸溶液將飛燕草素-3-半乳糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷、錦葵素-3-半乳糖苷、芍藥素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-蕓香糖苷、牽?；ㄋ?3-半乳糖苷、錦葵素-3-阿拉伯糖苷、牽?；ㄋ?3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷11種花青苷標準品配制成質量濃度分別為0、10、30、50、100μg/L的混合標準溶液，利用優化好的液相色譜和質譜條件依次進行測定。以峰面積對質量濃度繪制標準曲線，如表2所示，11種化合物的線性相關系數（r）為0.9950～0.9996，表明各化合物在0～100μg/L范圍內線性關系良好，本方法能夠滿足檢測需求。取被多次提取花青苷后的樣品殘渣作為空白基質，采用在空白基質中添加目標化合物的方法，以3倍信噪比確定檢出限，以10倍信噪比計算定量限，結果見表2。

表2 11種花青苷的線性方程、相關系數、檢出限和定量限

2.4 不同藍莓品種的花青苷種類和含量分析

采用本試驗建立的方法對高灌藍莓品種‘藍豐’和‘喜來’以及兔眼藍莓品種‘藍冠’的花青苷類物質進行定性和定量檢測，從‘喜來’和‘藍冠’中分別檢測出11種花青苷類物質，從‘藍豐’中檢測出10種花青苷類物質（表3）。不同品種間各花青苷類物質的含量存在明顯差異?！{豐’的總花青苷含量為3 460.8 mg/kg，其中錦葵素-3-阿拉伯糖苷含量最高，其次是飛燕草素-3-葡萄糖苷；‘喜來’的總花青苷含量為3 194.6 mg/kg，其中含量最高的是飛燕草素-3-葡萄糖苷，其次是錦葵素-3-半乳糖苷；‘藍冠’的總花青苷含量為4 866.6 mg/kg，其中含量最高的是矢車菊素-3-葡萄糖苷，其次是錦葵素-3-阿拉伯糖苷。

表3 不同藍莓品種的花青苷種類及含量

3 結論

本研究以‘藍豐’‘喜來’和‘藍冠’為試材，建立了利用超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜技術對藍莓中花青苷類物質進行定性和定量分析的方法。該方法快速、準確，在0～100μg/L范圍內線性關系良好，r值為0.9950～0.9996，能夠滿足檢測需求。利用該方法分別從‘喜來’和‘藍冠’中鑒定出11種花青苷，從‘藍豐’中鑒定出10種花青苷，且3個品種間各種花青苷類物質含量存在明顯差異，主要花青苷類物質種類和含量也存在一定差異——‘藍豐’中以錦葵素-3-阿拉伯糖苷和飛燕草素-3-葡萄糖苷含量較高，‘喜來’中以飛燕草素-3-葡萄糖苷和錦葵素-3-半乳糖苷含量較高，‘藍冠’中則以矢車菊素-3-葡萄糖苷和錦葵素-3-阿拉伯糖苷含量較高。本研究結果可為藍莓優異種質挖掘及富含花青苷的新品種選育提供理論依據。