基于低場二維核磁共振的油茶籽油鑒別與摻兌檢測

王 欣 傅利斌

(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093)

0 引言

油茶籽油是中國的特色油脂之一，其原料產區主要分布于湖南、江西、廣西等省份[1]。油茶籽油的脂肪酸組成與橄欖油極為相似，含有維生素E、甾醇、角鯊烯等多種抗氧化活性物質，具有預防心腦血管疾病等功效[2-4]。由于具有獨特的風味和高營養價值，油茶籽油逐漸得到了消費者的認可。然而，不法商家為了攫取暴利而以其他植物油摻兌或直接假冒油茶籽油的現象時有發生[5-6]。因此，研究針對油茶籽油真偽及摻兌鑒別的檢測方法具有重要意義。

作為一種新興的快速、無損檢測技術，低場核磁共振技術(Low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)在油脂檢測領域有很大的應用潛力?；贚aplace變換的低場時域核磁共振弛豫信息一般包括縱向弛豫時間T1(自旋-晶格)和橫向弛豫時間T2(自旋-自旋)圖譜兩方面。文獻[7]在大量分析不同溫度和壓力下的原油樣品的T1數據的基礎上，建立了T1與粘度間的相關性模型。T2除與油脂的粘度密切相關外[8]，也與食用油的脂肪酸組成及含量有關[9-10]，在食用油氧化過程中，T2弛豫信息與過氧化值、共軛二烯含量、總極性化合物含量等均存在良好的相關性[11-12]。目前，應用低場核磁橫向弛豫時間T2的分析研究相對較多[13-14]，但一維低場核磁共振技術面對復雜樣品所能獲取的信息是有限的，同時較高的光譜重疊效應也會影響其檢測能力[15]。實際上，低場二維核磁共振技術(LF-2D-NMR)可以提供更為豐富的信息[16]，LF-2D-NMR可以獲取與分子運動特性(縱向弛豫時間T1、橫向弛豫時間T2、擴散系數D等)有關的時域譜信息，并可以將其直觀地反映為峰分布情況的變化。目前，LF-2D-NMR在石油勘探領域可用于表征水和油的分布情況[17]，在食品及果蔬的品質分析中則可用于確定含水率及儲藏過程中的水分遷移情況[18-19]。在油脂摻兌方面，文獻[20]使用一維和二維圖譜對橄欖油、摻兌葵花籽油/紅花籽油的橄欖油進行分類識別，發現二維圖譜具有更好的分類識別效果。文獻[21]利用低場T1-T2二維圖譜特征信息實現了對4種食用油的分類識別。文獻[22]研究發現，低場T1-T2二維圖譜可用于表征食用油中不飽和脂肪酸的氧化?？傮w來看，LF-2D-NMR在食用油檢測尤其是食用油鑒別及摻兌檢測方面的應用效果仍有待進一步研究。

基于以上分析，本文以識別油茶籽油為目標，對多種正常及氧化狀態的食用油的低場T1-T2二維核磁共振圖譜特征進行采集，進而結合化學計量學方法，如PLS-DA(偏最小二乘判別分析)和PLS(偏最小二乘回歸)，分別建立油茶籽油與其他植物油及氧化油脂的定性分類模型及摻兌油茶籽油的定量分析模型，為建立基于LF-2D-NMR技術的油茶籽油快速鑒別方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

油茶籽油(Camelia oil,CAO)、菜籽油(Rapseed oil,RAO)、花生油(Peanut oil,PEO)、稻米油(Rice oil,RIO)、玉米油(Corn oil,CO)、大豆油(Soybean oil,SO)、葵花籽油(Sunflower oil,SUO)、亞麻籽油(Linseed oil,LIO)購于上海市楊浦區沃爾瑪商場。

冰乙酸(分析純)、硫代硫酸鈉(分析純)、碘化鉀(分析純)、三氯甲烷(分析純)、可溶性淀粉(分析純)、無水碳酸鈉(分析純)購于上海國藥化學集團有限公司。

油茶籽油二元摻兌油樣：向油茶籽油中分別加入一定量的玉米油、大豆油或葵花籽油，最終得到3個系列摻兌量(其他植物油質量分數)為0、20%、40%、60%、80%、100%的二元混合樣品(CAO+CO,CAO+SO,CAO+SUO)，充分混合后儲藏于4℃冰箱備用。

氧化油樣(Oxi-oil)：采用干燥箱加速氧化法[23]制備氧化油樣，分別取8種植物油各500 mL于1 L燒杯中，在105℃干燥箱中敞口、避光氧化4 d，樣品冷卻至室溫(20℃)后密封冷藏于4℃冰箱中備用。依據文獻[24]進行樣品過氧化值(Peroxide value, Pov)的測定，結果以g/(100 g)表示。采用Testo270型極性化合物檢測儀進行總極性化合物(Total polar compounds,TPC)質量分數測定[25]。

油樣的過氧化值及總極性化合物質量分數如表1所示。

表1 氧化油樣的過氧化值與總極性化合物質量分數Tab.1 Pov and TPC of Oxi-oils

1.2 儀器與設備

PQ001-020-015V型LF-NMR儀(磁場強度0.5 T，脈沖頻率20 MHz，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司)；XW-80A型微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；HH-S21型恒溫水浴鍋(上海博訊實業有限公司)；Testo270型食用油品質檢測儀(德國德圖集團)；FA2204B型分析天平(上海越平科學儀器有限公司)；干燥箱(上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司)。

1.3 LF-2D-NMR檢測條件

準確移取2.5 mL樣品至直徑為15 mm的核磁專用試管中，35℃恒溫水浴20 min后在以下參數條件下檢測：IR-CPMG序列，儀器溫度35℃，采樣頻率(SW)250 kHz，重復采樣等待時間(TW)3 000 ms，重復采樣次數(NS)4，回波個數(NECH)5 000，半回波時間(DL2)1 ms，累加采樣次數(NTI)20。

樣品經檢測后得到如圖1a所示的原始衰減曲線，使用Matlab 2018軟件對原始衰減信息文件進行Laplace變換反演，得到如圖1b所示的T1-T2二維核磁共振圖譜，顏色深淺表示信號量大小，色彩亮度越高則信號量越大，色彩亮度越低則信號量越小。圖1c為T1-T2二維核磁圖譜的3D視角圖。使用Matlab 2018提取以下特征信息：總信號量TA、總像素數S、最大信號量C，T1的起始時間T1S及結束時間T1E、T2的起始時間T2S和結束時間T2E；當對T1-T2二維核磁圖譜3D視角圖在最大信號量為1/2處作水平橫截則還可獲得1/2峰高截面圖(圖1d)，從中可提取得到以下特征信息：截面處的T1起始時間T1SJ及結束時間T1EJ、截面處的T2起始時間T2SJ及結束時間T2EJ。

1.4 數據分析方法

應用SPSS 19.0的Duncan法進行顯著性分析，應用Origin 8.0繪圖；應用Matlab 2018進行原始數據反演。

(1)PLS-DA模型

(2)PLS模型

應用SIMCA 12.0，以樣品的TA、S、C、T1S、T1E、T2S、T2E、T1EJ、T2SJ、T2EJ信息作為數據變量，使用帕累托縮放對數據進行歸一化處理，通過偏最小二乘回歸(Partial least squares, PLS)建立油茶籽油摻兌其他食用油的定量預測模型。以交叉驗證均方根誤差(RMSECV)和預測均方根誤差(RMSEP)評估模型的準確性，以決定系數R2反映模型的線性擬合程度。當RMSECV最小時，確定模型最佳主成分個數。

(3)建模集與驗證集設置

所有定性分類及定量預測模型均使用2/3的樣本構建建模集模型，1/3的樣本作為外部驗證建立驗證集模型。

2 結果與分析

2.1 正常食用油的LF-2D-NMR弛豫特征

2.1.1正常食用油的LF-2D-NMR圖譜

圖2為不同食用油的LF-2D-NMR圖譜。由圖2可知不同食用油的T1-T2分布位置、形態及大小。整體來看，各食用油的T1-T2二維核磁圖譜均表現為橢圓型單峰，分布于圖譜對角線上。且油脂種類不同，其T1-T2二維核磁圖譜分布有所區別。相比之下，油茶籽油(CAO)在T1方向的分布較窄(30.22～659.02 ms)，而在T2方向的分布相對偏左，T2S為27.60 ms。菜籽油(RAO)、花生油(PEO)及玉米油(CO)的T1-T2分布相同，雖然大豆油(SO)與葵花籽油(SUO)的T1及T2起始時間相同，但SUO具有相對較大的T2E，故在T2方向上的分布更寬。稻米油(RIO)則在T1方向的分布上明顯下移，其T1S為27.60 ms,T2方向上則明顯左移，其T2S為19.21 ms；而亞麻籽油(LIO)的T1S為39.67 ms，明顯上移，在T2方向上則明顯右移，其T2S顯著高于其他植物油，為36.23 ms。

食用油的T1-T2分布與其脂肪酸組成有一定關系。研究表明，RIO中的氧化甘油三酯聚合物(TGP)、游離脂肪酸(FFA)、甘油二酯類(DG)等極性化合物相對較高[30]，而極性化合物的增多會使體系的T2弛豫時間相對減小，這與RIO在T2方向上的左移相符[31]。在T1方向上，油脂粘度越大，其T1弛豫時間越小[32-33]，而RIO與SO在40℃時的粘度分別為38cP和32.7cP[34]，使得RIO的T1二維圖譜峰在T1方向上明顯下移。

進一步選取視角角度為X:2°—Y:23°分析CAO和LIO的低場二維核磁圖譜3D視角圖，如圖2i與圖2j所示，油茶籽油表現為單峰，而亞麻籽油則為明顯的雙峰特征。這是由于LIO富含亞麻酸，其不飽和脂肪酸比例顯著高于油茶籽油，而不飽和脂肪酸中的雙鍵的增多使得氫質子核磁響應的不均勻度增大，進而出現了新的弛豫峰[10]。

2.1.2正常食用油二維圖譜特征

進一步提取8種食用油二維圖譜特征，其中，總信號量TA、總像素數S及最大信號量C如表2所示。

表2 8種食用油二維圖譜特征Tab.2 LF-2D-NMR spectrum information of edible oils

總信號量TA與樣品中氫質子的數量以及所處狀態有關。由表2可知，CAO的總信號量最大，為5 484.16±7.92，LIO總信號量最小，為5 225.78±17.64。RAO和PEO的總信號量無顯著性差異，分別為5 459.01±3.64和5 448.62±1.01，而CO的總信號量相對減小。此外，相比之下，這些富含單不飽和脂肪酸(MUFA)的油類，即CAO、RAO、PEO、RIO，其總信號量均在5 400以上，明顯大于以多不飽和脂肪酸(PUFA)為主的油類(CO、SO、SUO、LIO)。這可能是由于，隨著食用油中脂肪酸不飽和度的增加，體系中總的氫質子量相對減少，樣品的總信號量逐漸減小。

總像素數S是樣品峰在二維圖譜上所占的像素點的個數，可反映樣品峰在圖像上的面積。由表2可知，RIO總像素數高達703.50±1.22，明顯高于其他食用油。其次為LIO(659.16±7.96),而油茶籽油的總像素數最小，僅為623.33±4.54。但RAO與PEO、SO與SUO的總像素數無顯著差異。

最大信號量C是T1-T2二維核磁3D視角圖中最高峰的頂點信號量?？梢园l現，MUFA類油脂的最大信號量在17.13～18.94之間，其中，CAO的最大信號量為18.94±0.06，而PUFA類油脂的最大信號量均低于17.00，其中，SUO的最大信號量最小，僅為15.87±0.04。

圖3a、3c分別為8種食用油樣品的弛豫峰及1/2峰高截面處的起始與結束時間的比較。由圖3a可知，從T1方向來看，CAO、RAO、PEO、CO、SO、SUO等6種油樣的T1SJ相同，均為62.41 ms，食用油在T1SJ上的差異度相對小于T1S；而在T2方向上，CAO與PEO的T2SJ均為52.06 ms，而RAO、CO、SO、SUO的T2SJ均為57.00 ms。RIO的T1SJ和T2SJ最小，分別為57.00、47.55 ms。LIO的T1SJ與T2SJ最大，分別為68.34、62.41 ms。由圖3c可知，CAO的T1EJ與T2EJ均最小，分別為549.74 ms和383.54 ms。RAO與PEO的T1EJ相同(601.90 ms)，CO、SO的T1EJ相同(659.02 ms)，RIO、SUO、LIO的T1EJ分別為549.74、790.02、864.98 ms。8種食用油T1EJ的變化規律與T1E相同。對于T2EJ而言，除PEO與CO相同(502.10 ms)，其他6種食用油均不相同，且 PUFA型食用油(CO、SO、SUO、LIO)的T2EJ隨不飽和度增加而增大。

8種食用油的T1SJ、T2SJ、T1EJ、T2EJ與對應的T1S、T2S、T1E、T2E有著整體相似的變化規律，但對于部分T1-T2分布相似的食用油，截面處信息又存在差異。例如，RAO、PEO、CO在圖2a中的T1-T2分布雖然相似，但其T2SJ、T1EJ、T2EJ均有所區別。SO與SUO的T1-T2分布較為相似(圖2a)，但由圖3c可知，其T1EJ與T2EJ均存在差異，分別為659.02、549.74 ms和790.02、601.90 ms。因此1/2峰高截面處的起始與結束時間可以作為不同食用油低場二維核磁特征信息的有效補充。

2.1.3油茶籽油與食用油的PLS-DA分類模型

基于8種食用油的低場核磁共振二維圖譜信息建立針對油茶籽油的PLS-DA分類模型，結果如圖4(t1、t2分別表示主成分1和主成分2)所示。由圖4a可知，8種食用油在PLS-DA得分圖上可清晰區分。油茶籽油、菜籽油、花生油、稻米油等4種MUFA型油脂分布于得分圖的右半區域，而以玉米油、大豆油、葵花籽油、亞麻籽油為代表的PUFA型油脂則分布于得分圖的左半區域。油茶籽油位于得分圖的第1象限，與其他油脂區分明顯；稻米油則位于第4象限。亞麻籽油在得分圖上位于第3象限，明顯遠離其他油樣。此外，油脂的分布與脂肪酸組成有一定關聯，隨油脂脂肪酸不飽和度的增加，其在主成分t1方向上呈現從右往左的分布，規律良好。

此外，在PLS-DA模型中，變量的VIP值可以反映其在模型區分效果中的重要性，當VIP值大于1時，可以認為具有顯著作用。由圖4b可知，S、TA、T2E、T1E、T1EJ、T2EJ等6個變量的VIP值均大于1，具有顯著性作用。結合圖3可知，不同食用油T1、T2的結束時間與截面處結束時間的區別度相對較大，故在模型區分效果中的貢獻度更高。

2.2 氧化食用油的LF-2D-NMR弛豫特征

2.2.1氧化食用油的LF-2D-NMR圖譜

圖5為8種氧化食用油的低場T1-T2二維核磁圖譜。由圖5可知，氧化油茶籽油(Oxi-CAO)的T1、T2分布分別為30.22～721.55 ms和25.21～549.71 ms，與圖2a中正常油茶籽油的T1E、T2S相比，Oxi-CAO 在T1方向的分布變寬，而在T2方向上的分布相對左移。其他氧化食用油的T1S、T2S也發生不同程度的改變，例如，氧化玉米油(Oxi-CO)和氧化亞麻籽油(Oxi-LIO)的變化相對較大。玉米油氧化后，其T1S、T2S分別從正常狀態的33.09、30.22 ms分別減小至23.03、9.30 ms，分布位置明顯左移，且峰前部出現大量低信號量響應。由表1可知，Oxi-CO的總極性化合物質量分數高達36.5%，極性化合物的大量產生使樣品中的氫質子弛豫速率增大，表現為T2減小，峰相對左移[11]。此外，Oxi-LIO的T1S、T2S分別從正常狀態的39.67、36.23 ms減小至30.22、21.03 ms，分布位置也相對左移。這與亞麻籽油富含亞麻酸，脂肪酸不飽和度高，極易被氧化密切相關[35]。

與正常油樣相比，除Oxi-CAO、Oxi-SO、Oxi-SUO的T2E保持不變外，其他幾種氧化食用油的T2E均有所減小，結合T2S的變化可知氧化食用油在二維圖譜上的T2分布都發生了不同程度的左移。Oxi-RAO、Oxi-PEO、Oxi-RIO、Oxi-CO、Oxi-SO的T1E均出現不同程度的減小，結合T1S的變化，其在二維圖譜的T1方向的分布相對下移；而Oxi-CAO、Oxi-SUO與Oxi-LIO的T1E相對增大，即T1方向的分布變寬，這可能與氧化過程中生成的某些短鏈脂肪烴有關，較小的相對分子質量，分子間作用力較弱，使得質子自由度較大，弛豫時間變長[36]。

2.2.2氧化食用油二維圖譜特征

8種氧化食用油二維圖譜特征如表3所示。由表3可知，與正常油樣相比，氧化油樣總信號量TA均發生不同程度的下降，除氧化大豆油(Oxi-SO)、氧化葵花籽油(Oxi-SUO)外，其他6種氧化食用油總信號量下降幅度都在100左右。油脂在氧化過程中脂質分子失去氫離子生成自由基[37]，使得樣品中整體氫質子數量下降，進而導致總信號量降低。

表3 氧化食用油二維圖譜特征Tab.3 LF-2D-NMR spectrum information of Oxi-oils

同時，氧化油樣總像素數S相對增大，其中，Oxi-CO的總像素數增多最為明顯，從645.50±2.42增大至845.83±10.60。從二維譜圖中也發現低信號量響應，表現為峰前端出現拖尾現象。如圖5a所示，氧化亞麻籽油的峰前部出現大量顏色較淺、信號量較小的信號點，出現拖尾情況。

氧化油樣最大信號量C均有所降低，Oxi-CAO最大信號量降至17.72。Oxi-COC降幅最大，減少了2.04，而其總信號量也表現為顯著減小。

圖3b、3d分別為8種氧化油樣的弛豫峰及1/2峰高截面處的起始與結束時間的柱狀圖。觀察發現，Oxi-CAO的T1SJ與T1EJ分別為57.00、502.10 ms，與正常CAO的T1SJ(62.41 ms)和T1EJ(458.58 ms)相比，Oxi-CAO截面處的T1分布變寬且左移，而截面處T2分布無變化。由圖3b可知，Oxi-CO與Oxi-LIO的T1SJ、T2SJ分別為47.55、39.67 ms和57.00、52.06 ms，比正常CO(62.41、52.00 ms)與LIO(68.34、62.41 ms)明顯縮短。由圖3d可知，與正常油樣相比，Oxi-RAO、Oxi-PEO、Oxi-RIO、Oxi-CO、Oxi-SO的T1EJ減小，而Oxi-CAO、Oxi-SUO、Oxi-LIO的T1EJ增大；Oxi-CAO、Oxi-SO、Oxi-SUO的T2EJ不變，其他幾種氧化食用油的T2EJ則有所減小。8種氧化食用油在1/2峰高截面處的結束時間變化規律與弛豫峰結束時間的變化規律相同。

2.2.3油茶籽油與氧化食用油PLS-DA分類模型

為了鑒別油茶籽油與氧化油樣，提取正常油茶籽油與8種氧化油樣的二維圖譜特征信息建立PLS-DA模型，結果如圖6所示。

由圖6a可知，正常油茶籽油與8種氧化油樣在PLS-DA得分圖上可清楚區分。正常油茶籽油、氧化油茶籽油/菜籽油/稻米油/花生油均分布于得分圖的右半區域；氧化玉米油分布于得分圖上部，遠離其他油樣；氧化大豆油/葵花籽油/亞麻籽油則分布于得分圖的左半區域，其中氧化亞麻籽油單獨位于得分圖第2象限。從主成分t1方向看，正常油茶籽油位于最右端，其次是氧化油茶籽油，與正常油樣的分布類似，隨油脂脂肪酸不飽和度增加，氧化食用油呈現從右往左分布的規律。

2.3 油茶籽油摻兌其他油樣的定量模型

為了定量預測CAO+CO、CAO+SO、CAO+SUO體系中非油茶籽油組分質量分數，分別建立PLS定量預測模型，各模型的回歸系數如表4所示。

表4 油茶籽油二元摻兌PLS定量模型回歸系數Tab.4 Coefficient of PLS models for adulterated camellia oils

表5 油茶籽油二元摻兌PLS定量模型效果Tab.5 Performance of PLS models

3 結束語

對不同種類食用油以及不同摻兌水平的油茶籽油調和油的低場T1-T2二維核磁圖譜信息進行了研究，結果表明，油茶籽油、菜籽油、花生油、稻米油、玉米油、大豆油、葵花籽油、亞麻籽油的低場T1-T2二維核磁圖譜信息存在差異，采用PLS-DA模型可對油茶籽油與其他7種食用油進行有效區分，模型判別正確率為100%；油茶籽油與氧化食用油在低場二維圖譜上存在明顯差異，且與7種氧化食用油(氧化菜籽油、氧化花生油、氧化稻米油、氧化玉米油、氧化大豆油、氧化葵花籽油、氧化亞麻籽油)的低場二維圖譜信息也有顯著區別，基于PLS-DA建立的油茶籽油與氧化食用油的模型判別正確率為100%；利用不同摻兌量的油茶籽油分別摻兌玉米油、大豆油、葵花籽油的二元混合樣品的低場二維核磁圖譜信息，建立油茶籽油二元摻兌PLS定量模型，模型擬合度優良，R2分別為0.988、0.962、0.941。本研究為利用LF-2D-NMR技術進行食用油種類鑒別及油茶籽油摻兌分析提供了依據。