微小RNA在糖尿病腎病發病機制中的研究進展

段英連 馬嬋娟

1山西醫科大學，太原 030000；2山西省人民醫院腎內科，太原 030053

Williams等[1]結合國際糖尿病聯合會發布的第9版《糖尿病圖集》的結果，對211個國家和地區的糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病情況進行了重新評估，估計2019年大約有4.63億人患有DM，預計這一數字將在2030年增加25%，在2045年增加51%。糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是一種進行性的腎臟疾病，可導致終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)，是DM患者預期壽命減少的主要原因。其特征是細胞外基質(extracellular matrix，ECM)蓄積，腎小球和腎小管基底膜增厚，腎小球系膜基質增加，最終導致腎小球硬化和腎小管間質纖維化，并伴有蛋白尿和腎功能下降[2]。

一般來講，DKD患者的臨床預后較差，原因之一為臨床癥狀出現延遲，這種癥狀通常在腎臟損害實際開始后5～10年顯現出來。因此，臨床上DKD需要早發現、早干預，以減輕腎功能的喪失并改善預后。目前尿微量白蛋白已成為臨床上DM早期腎臟損害的最廣泛接受的實驗室篩查指標，但早在2006年一項英國的2型糖尿病腎功能不全的危險因素的前瞻性研究表明，部分DM患者在出現腎功能不全之前，患者的尿蛋白或尿微量白蛋白可能表現為陰性[3]。所以，對于某些DKD患者而言，尿微量白蛋白既不是腎功能不全的準確標志，也不是DKD疾病進展的可靠預測因子。由于現有的實驗室化驗篩查指標暫不能在腎功能減退真正發生之前確定那些有發展為微血管并發癥風險的患者，因此積極尋找DKD腎臟損害早期階段的標記物可為預防腎臟功能喪失提供巨大的臨床益處。微小RNA(microRNA,miRNA)很穩定，可以在人的體液中檢測到，已作為腎臟生物標志物獲得了優勢，并為腎臟疾病包括DKD在內的診斷和監測中的提供補充[4]?，F已明確DKD發病機制與細胞外基質積累、氧化應激、炎癥反應、自噬等有關[5]，本文將對miRNA在這些機制中的調控作用進行綜述。

一、miRNA簡介

DNA元素百科全書(the Encycldia of DNA elements，ENCODE)項目的開始，標志著非編碼RNA(non-coding，ncRNA)的存在，提示它們構成了人類基因組的主要組成部分(約75%)，并且它們在基因表達中起主要作用。miRNA是多細胞動物中核苷酸長度為20～30的ncRNA之一，主要通過參與靶mRNA降解或阻遏其翻譯而調控基因表達，對發育、造血、器官發生、細胞增殖等具有調控作用。miRNA穩定性較高，可以在人的體液中檢測到，參與許多疾病發生發展的調控，特別是在DM和腎移植受者病程進展至慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的患者中，miRNA的表達與腎小管間質硬化和終末期腎小球病變發生相關，miRNA作為一種有潛力的生物標志物在未來臨床發展中有廣闊的前景[4]。

二、miRNA在DKD發病機制中的調控

1.miRNA與細胞外基質積累 眾所周知，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)蛋白在腎小球的系膜和基底膜以及腎小管間質中過度沉積是DKD的特征之一，它減少了濾過面積最終導致腎小球硬化[6]。過多的ECM積聚最終會導致腎小球硬化，這是進行性腎功能喪失的第一步，也是至關重要的一步。形態學檢查顯示，在體內和體外，上皮-間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)發生、ECM沉積和腎纖維化病變均表現為E-鈣粘蛋白(E-cadherin，E-cad)表達降低，α平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)和膠原蛋白Ⅲ含量增加。

系膜細胞的肥大表型具有成纖維細胞的特征，具體表現為α-SMA、平滑肌22蛋白(smooth muscle 22，SM22)和ECM蛋白(如Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ型膠原蛋白和纖連蛋白)的表達升高。Wang等[7]通過基因芯片分析發現糖尿病db/db小鼠腎皮質中miR-214水平顯著上調，進一步體外實驗表明抑制miR-214上調可顯著降低SM22、α-SMA和Ⅵ型膠原蛋白的表達，并且在人胚胎腎細胞中通過熒光素酶測定法將PTEN鑒定為miR-214的靶基因，隨后實驗證實部分恢復PTEN水平，可減弱白蛋白尿和腎小球系膜的擴張。這些體內和體外的研究表明miR-214和PTEN之間的串擾可減輕腎小球肥大。因此，miR-214可能是DKD的新型治療靶點。Yu等[8]在DKD大鼠實驗中觀察到miR-370、纖連蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅳ型膠原蛋白和纖溶酶原激活物抑制-1(plasogen activator inhibitor 1，PAI-1)表達升高，但canopy 1(CNPY1)表達降低；之后經生信軟件及熒光素酶測定確定了CNPY1為miR-370的靶基因，并發現miR-370的過表達通過抑制CNPY1來促進腎小球系膜細胞增殖和ECM積累。上述研究列舉了miRNA調控ECM蛋白合成過程中的靶基因，通過探索miRNA與靶基因之間的信號通路網絡調控關系，對未來實現DKD的靶向治療提供了思路。

轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/Smad2/3信號傳導途徑是參與DKD腎臟纖維化形成的公認途徑。TGF-β1與其受體結合后，通過兩個關鍵的下游介質Smad2和Smad3發出信號，誘導腎小管上皮細胞發生EMT，從而促進ECM蛋白的產生及沉積，最終發展為廣泛的腎組織纖維化，而此過程受到Smad7負反饋調節。Wang 等[9]在體內(鏈脲佐菌素誘導的DM大鼠模型)和體外(高葡萄糖條件下的大鼠腎小管上皮細胞模型)研究了SnoN蛋白與miR-21、TGF-β途徑之間的關系。他們發現在這兩個模型系統中，SnoN蛋白的表達量與miR-21成反比，SnoN蛋白對TGF-β途徑起負調節作用，miR-21通過激活TGF-β1/Smads信號轉導途徑增強了ECM沉積和α-SMA表達而在DKD中發揮作用。既往研究已證明鈣釋放激活鈣通道蛋白1(calcium release-activated calcium channel protein 1，Orai1)通過TGF-β1/Smad3途徑參與TGF-β1誘導的EMT。Ma等[10]觀察到腎纖維化組織和TGF-β1誘導的人腎小管上皮細胞(HK-2細胞)中miR-93顯著降低，而且DKD中miR-93表達的降低導致Orai1表達增加，之后促進了TGF-β介導的ECM積聚和纖維化。Sun等[11]運用qRT-PCR測定miR-133b和miR-199b在OLETF大鼠、LETO大鼠和TGF-β1在HK-2細胞中的表達；通過蛋白質印跡法和免疫組化檢測膠原蛋白I、纖連蛋白、α-SMA、E-cad和sirtuin 1(SIRT1)的表達水平；通過Masson染色以評估腎纖維化程度；通過熒光素酶報告基因分析和RNA免疫沉淀分析探索了SIRT1與miR-133b、miR-199b之間的相互作用。最終結果表明，通過上調SIRT1抑制miR-133b和miR-199b的表達可減輕TGF-β1誘導的EMT和腎纖維化，這表明使用不同的miRNA是將來治療DKD的潛在策略。

Kato等[12]觀察到在DKD小鼠模型的腎小球中以及用TGF-β1或高葡萄糖治療的腎小球膜細胞中，近40個miRNA的大型簇及其宿主長的非編碼RNA轉錄物(long non-coding RNA transcript，lnc-MGC)協同增加。靶向lnc-MGC的化學修飾寡核苷酸可抑制DM小鼠的簇微RNA、腎小球ECM和肥大。因此，抑制lncMGC的表達可以作為DKD的潛在療法，以降低內質網應激后miR-379簇上調誘導ECM積累和肥大的作用。骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是TGF-β超家族中的關鍵成員之一。研究發現在腎纖維化期間，BMP的增加可抑制TGF-β1介導的腎小管上皮細胞中的EMT和ECM積累，從而發揮抗小管間質纖維化的作用[13]。Liu等[14]實驗發現BMP-7的表達可以通過調節miR-21/Smad7來影響TGF-β1/Smad3信號通路，抑制EMT和ECM沉積，參與了DKD的抗纖維化過程。目前的研究中，有報道表明NEAT1在鏈脲佐菌素誘導的DKD大鼠模型和高糖誘導的小鼠系膜細胞中顯著增加。研究者們發現，敲除NEAT1會抑制DKD大鼠的腎損傷，并且會下調NEAT1調節的ECM蛋白(ASK1、纖連蛋白和TGF-β1)和EMT蛋白(E-鈣黏著蛋白和N-鈣黏著蛋白)的表達。Wang等[15]發現，鋅指E-box結合同源盒1(zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)為miR-27b-3p的靶標，揭示了NEAT1在DKD的纖維化和EMT中的潛在作用。他們的實驗證明NEAT1可以通過調節miR-27b-3p和ZEB1來抑制DKD的進展，NEAT1可以作為DKD的有效生物標志物和治療靶標。

2.miRNA與氧化應激 氧化應激是指機體在受到各種有害刺激時，氧化系統和抗氧化系統之間平衡失調，導致組織細胞損傷。氧化應激已被證實為DKD組織損傷的關鍵機制之一[16]，許多介質參與了這一過程，但最重要的是高血糖癥本身以及糖基化終產物的產生，這些終產物能觸發活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)的產生和線粒體功能障礙。同樣，內在抗氧化反應的誘導通過核因子E2相關因子(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，NRF2)轉錄途徑的激活而發生。Li等[17]發現miR-25可減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞的氧化應激和凋亡。他們首先使用miRNA芯片測定了DKD患者腎臟組織及血清樣品中miR-25的表達情況，發現miR-25下調，血清miR-25水平與蛋白尿成反比關系；隨后在高糖處理的人腎小管細胞中發現miR-25的過表達通過PTEN/AKT信號途徑減少了ROS的產生，抑制了高糖誘導的細胞損傷模型中的細胞凋亡，減輕腎功能損傷。

眾所周知，解偶聯蛋白-2(uncoupling protein-2，UCP-2)直接參與調節線粒體膜電位，UCP-2的過表達可降低ATP的產生，防止DM大鼠腎臟中線粒體ROS過多形成[18]。Yang等[19]測定DKD大鼠外周血中miR-214的表達，用ELISA法測量氧化應激和ROS水平。實驗結果表明，DKD大鼠的外周血中miR-214表達顯著降低。隨后的體外實驗表明，在HK2細胞中miR-214的過度表達可調節UCP2表達及其下游途徑，ROS/AKT/mTOR信號通路顯著降低。他們的實驗發現miR-214的高表達可調節ROS/Akt/mTOR信號通路從而抑制DKD中的氧化應激，發揮腎臟保護作用。

Nrf2作為一種轉錄因子，在細胞氧化應激中有重要的調控功能，可維持氧化還原穩態。內在抗氧化反應的誘導通過抑制Nrf2阻遏物Keap-1而激活Nrf2轉錄途徑產生。激活此途徑的化合物已經在臨床試驗中進行了測試，表明Nrf2轉錄的激活是DKD的潛在治療靶點[20-21]。對糖尿病GK大鼠和Wistar大鼠進行定量miRNA轉錄組分析陣列，免疫組織化學和蛋白質印跡研究發現miR-200a表達增加后可激活Nrf2轉錄途徑激活抗氧化防御酶，進而減輕DM所致腎組織損傷[22]。

NADPH氧化酶衍生的超氧化物是高血糖誘導的DKD氧化應激的關鍵。NOX4是腎臟組織中NADPH氧化酶的主要亞基，在微血管內皮、腎小球系膜細胞和足細胞中顯著表達[23-24]。Fu等[25]實驗中發現糖尿病大鼠腎臟和高糖處理的系膜細胞中的miR-25水平均顯著降低，并伴隨著NOX4表達水平的增高。隨后通過熒光素酶報告基因檢測法直接靶向NOX4的3'-UTR，表明miR-25對NOX4表達負調控，最終結果揭示miR-25作為內源性基因沉默因子調節DKD中NOX4基因的表達，影響DKD氧化應激。此外，NOX4基因的表達也受到miR-423-5p的調控。Xu等[26]在DKD患者腎臟組織中miR-423-5p下調，但在體外培養的足細胞中HG誘導NOX4抑制了miR-423-5p表達。這項研究表明，miR-423-5p過表達可通過靶向NOX4抑制ROS的生成來保護HG誘導的足細胞損傷，從而提供了針對DKD的潛在治療策略。Oh等[27]在之后的實驗中發現，miR-25的表達還受到與Homeodomain相互作用的蛋白激酶2(homeodomain-interacting protein kinase 2，HIPK2)的調控，表明在維持ROS方面，HIPK2-miR-25-NOX4的調控復雜。這些研究進一步重申了NOX4對DKD氧化應激復雜而嚴格的調控。

3.miRNA與炎癥反應 DKD的發病與全身和腎臟局部炎癥反應有關。一些炎性細胞因子如白介素(interleukin，IL)、腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor，TNF)、單核細胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP)、巨噬細胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)、免疫介質和黏附分子水平會隨著疾病的進展而增加[28]。

Petrica等[29]探究了2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)合并DKD患者的血清和尿液中ILs(IL-α、IL-8、IL-18)與不同miRNAs(miRNA-21、124、125a、126、146a、192)的相關性。值得注意的是這項研究發現IL-α與miRNA-125a、126、146a和192負相關，這些miRNAs都具有腎臟保護作用。Rovira-Llopis等[30]測定了T2DM合并DKD患者血清TNFα、IL-6和細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的水平，評估了miR-31與這些細胞因子的表達關系，發現miR-31與TNFα和IL-6與ICAM-1之間呈負相關關系。這表明隨著miR-31水平的降低而炎癥反應加劇，并且發現miR-31調控DKD與炎性因子和黏附分子促進白細胞募集到血管壁有關，他們推測miR-31可作為DKD敏感的預后生物標志物。Huang等[31]在DKD患者、1型糖尿病大鼠和2型糖尿病大鼠模型實驗中得出了一致的結論，miR-155和miR-146a的表達增加可加重炎癥介導的腎小球內皮損傷。Zhao等[32]發現db/db小鼠腎臟組織中的miRNA-337表達上調可增加IL-6和IL-18的水平而導致足細胞損傷。

在炎癥方面，miR-27a是一種促炎性miRNA，可負調節NRF2和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ)的表達，從而促進促炎性細胞因子的分泌。Hou等[33]在DKD動物和細胞模型中，發現miR-27a通過抑制PPARγ激活TGF-β/Smad3信號傳導，并促進結締組織生長因子，纖連蛋白和膠原I等纖維化的關鍵介質的表達變化。值得注意的是，此項研究發現miR-27a與血肌酐、蛋白尿、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的升高及腎小球濾過率的降低有關，具有臨床和生物學意義。因此，監測血漿miR-27a水平及其與PPARγ的關系可用于反映腎臟纖維化的嚴重程度，靶向miR-27a可作為DKD的潛在治療方法。單核細胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)是一種趨化因子，可將巨噬細胞募集到炎癥部位，對DKD的發生和發展很重要。Yang等[34]發現在DKD組織中miR-374a被下調而MCP-1被上調。隨后在HK2細胞中證實了MCP-1是miR-374a的靶標，并發現轉染miR-374a模擬物可下調IL-6、IL-18以及TNF的水平，并且在DKD患者腎小管上皮細胞中發現miR-374a表達的恢復阻止了炎癥反應。這些實驗表明，靶向miR-374a/MCP-1軸的治療策略可能是DKD的有效治療方法。另一個抗炎miRNA是miR-455-3p。Wu等[35]在HG或TGF-β1刺激的人腎小球系膜細胞(human glomerular mesangial cells，HGMCs)和HK-2細胞中發現miR-455-3p被下調，并將Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶2(Rho associated coiled coil containing procrastinate 2，ROCK2)確定為miR-455-3p的直接目標，miR-455-3p負調控ROCK2的表達，并因此減少了HGMCs中的炎性細胞因子和纖維化標記物。該實驗證明miR-455-3p通過抑制ROCK2表達在腎纖維化的治療中起著至關重要的作用，miR-455-3p可能作為DKD的治療靶點。

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)能識別各種微生物成分并誘導免疫反應，并且與DM的病理生理學有關。Ji等[36]用qRT-PCR法檢測了Gm6135和TLR4在DKD小鼠腎臟和高糖培養的小鼠系膜細胞中的相對表達水平。他們觀察到Gm6135/TLR4的過表達或下調會顯著影響小鼠系膜細胞的增殖和凋亡；最終得出了Gm6135通過競爭性結合miR-203-3p來上調TLR4，從而進一步激活DKD小鼠促炎性細胞因子的分泌。有趣的是，Yao等[37]發現TLR4基因表達也受到miR-874的負調控。研究表明，鏈脲佐菌素誘導的DKD大鼠模型和葡萄糖誘導的小鼠足細胞模型miR-874的過表達通過靶向TLR4抑制了葡萄糖觸發的足細胞損傷，并暗示miR-874/TLR4軸可能代表了DKD的病理機制。更深入地了解miRNA與DKD發病中炎癥反應的關系，有助于找到新方法去預防、治療或延緩DKD的進展。

4.miRNA與自噬 自噬作為許多生物學功能的重要途徑已引起廣泛關注。它在正常和疾病狀態(包括免疫力、炎癥、發育和衰老、代謝和神經退行性疾病以及癌癥)中起關鍵作用[38]。自噬是一種溶酶體蛋白降解途徑，可將細胞內成分傳遞至溶酶體進行降解以維持體內平衡和細胞完整性。自噬誘導是由雷帕霉素靶蛋白復合物1(Mammalian target of ropamycin complex 1，mTORC1)控制的，它可以感應和整合來自多種來源的應激信號，包括生長因子、氨基酸、低氧血癥和能量水平。在營養充足的條件下，mTORC1通過阻止Ulk1/2復合物的組裝而抑制自噬。自噬途徑并不孤立存在，而是與miRNA交叉調節的其他細胞信號網絡整合在一起?，F已確定miRNA在自噬的各個階段(包括誘導、囊泡成核、延伸和完成、對接和融合以及降解和再循環)具有關鍵作用。

近年來，人們越來越關注自噬在腎臟疾病中的作用，并發現自噬的缺乏會導致包括DKD在內的腎臟疾病的發病[39]。自噬誘導的起始步驟之一是Ulk1復合物的激活，它由AMPK-mTORC1通路直接調控。據報道，有幾種miRNA調節AMPK-mTORC1通路干擾上游自噬信號。Lu等[40]觀察到，高糖培養的系膜細胞中miRNA-21表達上調可上調靶基因PTEN的表達，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活，并增強自噬作用，以減少ECM蓄積并改善系膜細胞肥大和增殖。Matboli等[41]的實驗表明，高脂飲食或鏈脲佐菌素誘導的DM大鼠中調節某些miRNAs的水平觸發AMPK-PIK3途徑誘導自噬發生，可以減輕腎組織損傷。

Wang等[42]研究首次揭示了一個新的信號環路p53/miR-155-5p/Sirt1的存在，證明人腎近端腎小管細胞中miR-155-5p的過表達會抑制sirt1調節的自噬通路，并作為DKD的治療靶點。Xu等[43]發現miR-18a-5p在足細胞中的過表達導致對Caspase 3裂解蛋白的顯著抑制，并增加了LC3-II/LC3-I的比例；隨后通過雙重螢光素酶報告檢測進一步確定了共濟失調毛細血管擴張突變基因(ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM)是miR-18a-5p調控的靶基因。這項研究表明，miRNA-18a-5p可以通過靶向ATM基因來增強自噬作用，這可能是預防和減輕DKD的有希望的治療靶標。

在各種腎臟疾病中識別和鑒定miRNA可能使得新型診斷工具和治療干預手段的開發取得突破。盡管如此，還需要進一步研究，以確定自噬在更具體的疾病環境中是起保護作用還是加速病變發展。這些研究成果說明miRNA對自噬的調控可以影響DKD發展過程中的生物學功能，miRNA有望充當自噬途徑的新型有效調節劑，也為DKD的預防及治療提供了新思路[44]。

三、結語

DKD無論腎臟受累程度如何，它都會降低患者的生活質量并增加早期死亡的風險。目前DKD的治療效果差，往往進展到一定階段不可逆，所以盡早的診斷和及時的干預對DKD患者來說刻不容緩。目前侵入性腎臟組織穿刺活檢是診斷DKD的金標準，但價格較貴且有創，在患者無明顯癥狀的疾病早期階段不會選擇此種檢查手段，因此無法在疾病早期進行。miRNA生物標志物具有無創性和成本優勢，可作為有效的手段，可以在嚴重腎損害發生之前就發現腎臟代謝的變化。最近幾年，miRNA在腎臟的發育、生理及病理調控中已成為一個重要且富有成果的研究領域。然而，miRNA在腎臟疾病發展中的研究仍處于早期階段，但進展迅速。本文從miRNA在細胞外基質積累、氧化應激、免疫炎癥因素、自噬機制中的調控作用進行闡釋。相信未來更深入地對相關研究探索發現，可能會開發出普及的、固定的DKD相關miRNA數據庫，方便臨床工作者對DKD的早期診斷、預后預測、嚴重性評估和治療效果評價。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突