miR-105-5p靶向XAF1抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲的機制

艾恒玲 苗慧 趙歡 陳佳權 (牡丹江醫學院附屬第二醫院婦產科，黑龍江 牡丹江 157000)

宮頸癌是女性生殖系統常見惡性腫瘤，靶向治療是其治療方式之一〔1〕。micoRNA(miRNA)在細胞的增殖、分化和凋亡過程中發揮著重要功能，且大量研究證實miRNAs在宮頸癌的轉移和分化中扮演重要角色，可用作宮頸癌靶向治療的靶標〔2〕。研究發現miR-105在胃癌組織中明顯高表達，促進胃癌細胞增殖，增強其細胞活力、遷移能力，抑制其凋亡〔3〕。miR-105過表達能促進肝癌細胞G0/G1期阻滯，抑制肝癌細胞增殖〔4〕。在篩選差異表達miRNA時發現miR-105-5p在宮頸癌細胞中上調表達〔5〕，但其對宮頸癌細胞遷移、侵襲等生物行為的影響及其機制目前還不清楚。XAF1是促凋亡的腫瘤抑制因子，拮抗X-連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)抗細胞凋亡作用的蛋白，在多種人類癌癥中失活或下調表達，過表達XAF1可誘導凋亡、抑制增殖〔6〕。XAF1在宮頸癌組織中下調表達，促進其表達會抑制宮頸癌發生及發展過程〔7〕。本文旨在研究miR-105-5p對宮頸癌細胞遷移和侵襲的影響及其機制是否與XAF1有關。

1 材料與方法

1.1材料 宮頸癌細胞HeLa、SiHa和正常宮頸細胞Ect1/E6E7購自中國科學院上海細胞庫；RPMI1640培養基購自美國Gibico公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；Transwell小室、Matrigel購于美國BD公司；RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與分組 宮頸癌細胞HeLa、SiHa和正常宮頸細胞Ect1/E6E7使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基；取對數生長期細胞HeLa，將其分為miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-105a-5p組(轉染miR-105a-5p mimics)、anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)、anti-miR-105a-5p組(轉染anti-miR-105a-5p)、pcDNA3.1組(轉染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-XAF1組(轉染pcDNA3.1-XAF1)、anti-miR-105a-5p+si-NC組(共轉染anti-miR-105a-5p和si-NC)、anti-miR-105a-5p+ si-XAF1組(共轉染anti-miR-105a-5p和si-XAF1)。

1.2.2qRT-PCR檢測miR-105a-5p和XAF1 mRNA表達水平 提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA，按照試劑盒說明配制反應體系，進行PCR擴增，相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.2.3Western印跡檢測蛋白的表達 提取總蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用脫脂奶粉封閉后，分別加入一抗和二抗孵育，然后進行顯影、定影，檢測蛋白條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。

1.2.4Transwell檢測細胞遷移和侵襲 遷移實驗：Transwell小室接種細胞，下室加入含血清培養液，培養24 h，擦去上層細胞，甲醛固定、結晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并計數。侵襲實驗：Transwell上室平鋪Matrigel，其余同遷移實驗。

1.2.5熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-105-5p對XAF1的靶向調控 構建野生型和突變型XAF1的3′UTR熒光素酶表達載體(WT-XAF1和MUT-XAF1)，將其分別與miR-NC和miR-105-5p共轉染至HeLa細胞中；依據說明書要求檢測熒光素酶活性。

1.3統計學分析 采用SPSS20.00軟件進行t檢驗，方差分析。

2 結 果

2.1miR-105-5p在宮頸癌細胞HeLa、SiHa和正常宮頸細胞Ect1/E6E7中的表達 與正常宮頸細胞Ect1/E6E7(0.16±0.01)相比，宮頸癌細胞HeLa、SiHa中miR-105-5p的表達水平顯升高(0.89±0.09、0.42±0.04，F=251.449，P=0.000)。

2.2抑制miR-105-5p表達對宮頸癌細胞遷移、侵襲的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-105a-5p組宮頸癌細胞遷移和侵襲數量顯著降低，MMP-2蛋白的表達水平顯著降低，E-cadherin蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05),見圖1，表1。

圖1 抑制miR-105-5p表達對宮頸癌細胞遷移、侵襲蛋白表達的影響

2.3miR-105-5p靶向、調控XAF1 TargetScan數據庫預測顯示XAF1與miR-105-5p存在結合位點(圖2)。miR-105-5p與WT-XAF1轉染后的細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；miR-105-5p與MUT-XAF1轉染后的細胞熒光素酶活性差異不顯著，見表2。與miR-NC組比較，miR-105-5p組XAF1表達水平顯著降低，與anti-NC組比較，anti-miR-105-5p組XAF1表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖3，表3。

圖2 Western印跡檢測XAF1的3′UTR含有miR-105-5p的互補序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

1～4：MiR-NC組、miR-105a-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-105a-5p組圖3 Western印跡檢測XAF1蛋白的表達

表3 miR-105a-5p調控XAF1的表達

2.4過表達XAF1對宮頸癌細胞遷移、侵襲的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-XAF1組宮頸癌細胞遷移和侵襲數量顯著降低(P<0.05)，MMP-2蛋白表達水平顯著降低，XAF1和E-cadherin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見表4，圖4。

圖4 過表達XAF1對宮頸癌細胞蛋白表達的影響

2.5抑制XAF1表達能逆轉抑制miR-105-5p表達對宮頸癌細胞遷移、侵襲的作用 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-105a-5p組宮頸癌細胞遷移和侵襲數量顯著降低，MMP-2蛋白表達顯著降低，XAF1和E-cadherin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與anti-miR-105a-5p+si-NC組相比，anti-miR-105a-5p+ si-XAF1組宮頸癌細胞遷移和侵襲數量顯著升高，MMP-2蛋白表達水平顯著升高，XAF1和E-cadherin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖5，表5。

1～4：Anti-miR-NC組、anti-miR-105a-5p組、anti-miR-105a-5p+si-NC組、atin-miR-105a-5p+si-XAF1組圖5 抑制XAF1表達能逆轉抑制miR-105-5p表達對宮頸癌細胞遷移、侵襲蛋白表達的影響

3 討 論

宮頸癌是僅次于乳腺癌的第二大女性惡性腫瘤，雖然手術、放化療等治療方式已延長患者的生存時間，改善患者的生存質量，但臨床上對于晚期和復發型宮頸癌的治療仍較為棘手分子水平上的靶向治療可達到提高療效、減少毒副作用的目的〔8〕。研究發現miRNA影響宮頸癌的進展，研究miRNA有利于宮頸癌的早期診斷治療及預后評估〔9〕。miR-105通過MYC依賴的基質細胞代謝促進腫瘤生長〔10〕；miR-105通過下調SFRP1激活Wnt/β-連環蛋白信號傳導，從而促進三陰性乳腺癌細胞的干性，化學抗性和轉移〔11〕。miR-105在結直腸癌中的上調與侵襲性表型相關，miR-105表達參與TNF-α誘導的上皮-間質轉化(EMT)〔12〕。miR-105的表達在胃癌組織中降低，miR-105的過表達抑制胃癌細胞增殖和進展〔13〕。在本實驗中，miR-105a-5p在宮頸癌細胞中表達升高，抑制miR-105a-5p表達可抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲，抑制MMP-2蛋白的表達，促進E-cadherin蛋白的表達。

XAF1是一種抑癌基因，是XIAP最強的抑制因子，參與多種腫瘤的進展。研究其在腫瘤中的作用機制，對相關癌癥的治療具有重要意義，可作為分子靶向治療的靶點。研究發現XAF1非小細胞肺癌中下調表達〔14〕；XAF1在口腔鱗癌組織中低表達，過表達XAF1抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的生長，促進細胞凋亡〔15〕；Xaf1抑制表達會抑制結腸癌細胞凋亡〔16〕。XAF1與IRF-1形成正反饋環，增加了應激誘導的細胞凋亡并降低了腫瘤細胞的侵襲能力〔16〕。沉默HS6ST3通過誘導XAF1來抑制乳腺癌細胞的生長和進展〔17〕。內毒素刺激的巨噬細胞產生大量IFNβ，而IFNβ通過增加XAF1的表達誘導胰腺β細胞凋亡〔18〕。XAF1在宮頸上皮內瘤變及宮頸癌組織中低表達，與宮頸鱗癌癌變相關〔19〕。本實驗結果表明過表達XAF1可抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲，抑制MMP-2蛋白的表達，促進E-cadherin蛋白的表達。且miR-105a-5p靶向負調控XAF1，抑制XAF1表達逆轉了抑制miR-105a-5p對宮頸癌細胞遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，抑制miR-105a-5p表達可能通上調XAF1抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲。