miR-30a抑制Ang2誘導的大鼠心肌細胞系H9c2自噬

于甜樂，馬 晗，吳新華，陳章榮，孫 彪，彭 媛，劉 宏*

(1.大理大學 臨床醫學院，云南 大理 671000；2.云南省滇東北區域醫療中心 呼吸內科，云南 昭通 657000;3.大理大學第一附屬醫院 心血管內科，云南 大理 671000；4.云南省跨高原心血管疾病防治工程研究中心，云南 大理 671000； 5.大理大學 跨高原心血管疾病防治研究所，云南 大理 671000)

血管緊張素2(angiotensin2，Ang2)是腎素-血管緊張素系統的主要活性肽，在體內過量表達給心血管系統帶來了不利影響。多項研究[1-2]表明，Ang2誘導的心血管疾病過程中有自噬的參與。細胞自噬本質上是指細胞內異常的細胞器、折疊錯誤的蛋白質被溶酶體降解為氨基酸等小分子物質并再次利用的過程，是細胞的自我更新和修復的過程。當細胞遭受到饑餓、缺氧、代謝異常等胞內外刺激后，細胞發生自噬，在一定程度上維持細胞內動態平衡，是一種經典的維持細胞生存的機制[3]。自噬的調節與心臟疾病密切相關，參與了包括心肌病、心臟肥大、缺血性心臟病、心力衰竭以及缺血-再灌注損傷等過程。心肌正常運轉依賴于基礎水平的細胞自噬，但過度自噬會使心肌細胞死亡，加快心血管疾病的發生發展過程[4]。miRNA是內源性(<22個核苷酸組成)單鏈非編碼RNA，與目標mRNA堿基互補配對影響mRNA的穩定性和翻譯，參與心肌細胞中多種病理生理過程，對心血管疾病的啟動和進展有重要的影響[5]。miR-30a表達與自噬相關，且負向調控自噬[6]。miR-30家族可通過自噬參與心血管疾病相關的心室重構，體外研究發現miR-30a通過下調Beclin-1的表達來抑制細胞自噬[7]。本研究在細胞水平上探討miR-30a對Ang2誘導的大鼠H9c2心肌細胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠心肌細胞系H9c2(上海中國科學院細胞庫)；胎牛血清、Opti-MEM培養基和DMEM/高糖培養基(Gibco公司)；反轉錄試劑盒和RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)；引物、RT試劑和熒光定量PCR試劑(Western Biotechnology公司)；血管緊張素2(Sigma-Aldrich公司)；LC3(兔來源)一抗、Beclin-1(兔來源)一抗和GAPDH(兔來源)一抗(Abcam公司)；山羊抗兔IgG二抗和山羊抗鼠IgG二抗(Sigma-Aldrich公司)；羧基熒光素(FAM)標記的miR-30a mimics和miR-30a inhibitor (上海吉瑪公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理：將H9c2細胞轉移至培養皿中，待細胞匯合度達80%時，進行實驗。將細胞分為對照組、Ang2(2×10-6mol/L的Ang2配制液)組、NE(5×10-6mol/L的NE配制液)陽性對照組、Ang2+miR-30a mimics組、Ang2+miR-30a inhibitor組、Ang2+miR-NC組。Ang2和NE組均處理48 h，miR-30a mimic、miR-30a inhibitor和miR-NC先轉染到細胞中，將H9c2細胞接種至孔板中，把Lipofectamine 2000稀釋液和siRNA稀釋液輕柔混勻，室溫下孵育20 min形成siRNA-Lipofectamine 2000混合物，將混合物加入各孔中后放入37 ℃培養箱中轉染6 h，更換完全培養基，培養24 h，轉染成功后予2×10-6mol/L的Ang2處理48 h。拍照并收集樣本。

1.2.2 RT-qPCR檢測miR-30a mRNA表達：通過GeneBank基因數據庫，查詢miR-30a mRNA 基因編號并用primer 5.0 軟件及Oligo7.0軟件設計相關的引物進行合成，生成引物設計序列；抽提總RNA；采用Bio Rad凝膠成像系統曝光采集圖片觀察條帶；測量總RNA濃度及純度，A260/280在1.8～2.0提示純度良好，可用于后續實驗，A260/230>1表明胍類、酚類等殘留較少；U6設置為microRNA的內參。qPCR反應體系配制：預混液(2×)5 μL、正向引物(10 μmol/L)0.5 μL、反向引物(10 μmol/L)0.5 μL、DNA模板去核酸酶水1 μL、去RNA酶水加至10 μL，將qPCR反應液移入96孔PCR反應板中，加入獲得的cDNA模板，進行qPCR反應，熔解曲線反應條件：95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。

1.2.3 Western blot檢測自噬相關LC3、Beclin-1蛋白表達：加入細胞裂解液收集細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度。配制10% SDS-PAGE分離膠分離蛋白，電泳1.5 h后進行轉膜，轉膜結束后用1×TBST洗膜1 min，加入5%脫脂牛奶封閉液，于搖床上常溫平緩搖動2 h。倒掉封閉液，1×TBST洗膜5 min×3次，分別加入預先稀釋好的一抗、二抗(1∶1 000稀釋)，于搖床上孵育抗體。設置曝光參數，進行圖片采集。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組H9c2細胞中miR-30a mRNA的表達

與對照組相比，Ang2組和NE組miR-30a mRNA表達明顯降低(P<0.05)；與NE組相比，Ang2組miR-30a mRNA表達明顯降低(P<0.05)(圖1)。

2.2 各組H9c2細胞中自噬蛋白的表達

與對照組相比，NE組和Ang2組LC3、Beclin-1自噬蛋白表達顯著升高(P<0.001)；與NE組相比，Ang2組LC3、 Beclin-1自噬蛋白表達顯著升高(P<0.001)(圖2)。

2.3 miR-30a對Ang2引起的心肌細胞自噬的影響

使用末端由FAM熒光標記的miR-30a mimics和miR-30a inhibitor轉染24 h后用熒光顯微鏡(激發波長480 nm，發射波長520 nm)檢測轉染效率，隨機選取心肌細胞轉染照片，根據細胞計數，其轉染率平均值>70%，說明細胞被miR-30a mimics和miR-30a inhibitor有效轉染(圖3,4)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with NE group圖1 各組H9c2細胞miR-30a mRNA的表達水平Fig 1 Comparison of miR-30a mRNA expression in H9c2 cells of each

細胞經轉染處理后使用Ang2刺激，Western blot檢測LC3、Beclin-1蛋白表達。相比Ang2組，Ang2+miR-30a mimics組LC3、Beclin-1蛋白表達均顯著降低(P<0.05)(圖5)。

3 討論

Ang2與多種心血管疾病密切相關，心臟衰竭過程的Ang2過表達是心室重塑的重要影響因素。ACEI、ARB是以Ang2為作用靶點的藥物，能夠明確改善心室重塑、降低心血管疾病死亡率[8]，因此，深入探討Ang2與心血管疾病的內在機制，對尋求有效的藥物治療靶點有重要意義，有研究表明Ang2可能通過誘導心肌細胞自噬參與心血管疾病的發生發展[9]。本研究在體外培養大鼠H9c2心肌細胞，采用2×10-6mol/L 的Ang2誘導H9c2細胞自噬，設立去甲腎上腺素陽性對照組，Western blot檢測自噬蛋白LC3、Beclin-1表達水平來判斷細胞自噬狀態，結果顯示特定濃度Ang2能夠引起心肌細胞自噬，本部分結果與Ang2相關的心肌細胞自噬結果一致，既往研究顯示心肌細胞過度自噬可能加重細胞肥大、纖維化等，是心臟衰竭發病過程中的重要機制，人參皂苷能通過AMPK/mTOR/PI3K途徑抑制Ang2引起的心肌細胞自噬[10]，單硝酸異山梨酯、白介素10也能夠抑制Ang2誘導的慢性心衰中的心肌細胞自噬過程[11]。

A.the protein expressions of LC3,Beclin-1 was detected by Western blot； B,C.the protein expression of LC3, Beclin-1 was compared in each groups; *P<0.001 compared with control group； #P<0.001 compared with NE group

圖3 miR-30a mimics轉染組圖片Fig 3 Images of miR-30a mimics transfection

圖4 miR-30a inhibitor轉染組圖片Fig 4 Images of miR-30a inhibitor transfection

A.the protein expressions of LC3,Beclin-1 was detected by Western blot; B,C.the protein expression of LC3, Beclin-1 was compared in each groups; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Ang2 group

有報道[12]表明Ang2處理新生大鼠心肌細胞48 h后細胞中LC3自噬蛋白明顯增加，且miR-30a參與細胞自噬過程[13]。本研究通過RT-qPCR檢測發現Ang2組miR-30a 基因表達水平較正常組明顯下降，并進一步猜測miR-30a可能參與了Ang2誘導的細胞自噬。為了證實miR-30a能夠影響Ang2誘導的H9c2細胞自噬，使用miR-30a mimics、miR-30a inhibitor、miR-30a NC轉染心肌細胞，發現過表達miR-30a能夠抑制Ang2誘導的H9c2細胞自噬。在此過程中，進一步抑制miR-30a，未能進一步增加心肌細胞自噬。既往研究[14-15]已證實miR-30a的靶基因是Beclin-1，可以靶向Beclin-1調控 LC3的表達，影響大鼠心肌細胞缺血再灌注誘導的自噬，從而影響心肌細胞的存活和凋亡。實驗中Ang2已經明確抑制了miR-30a表達，使用miR-30a inhibitor未能進一步影響自噬。

綜上所述，本研究證實了Ang2能成功誘導H9c2心肌細胞自噬，在此過程中miR-30a表達降低，miR-30a mimics能夠抑制Ang2誘導的細胞自噬。當然，Ang2誘導的細胞自噬涉及多條通路、多個靶點，本研究只探討了miR-30a這一調控因子，因此完整的Ang2相關的自噬通路機制仍需進一步探討；且miR-30a在Ang2誘導的心血管疾病中可能發揮重要作用，能夠成為新的潛在治療靶點。