黃韌帶肥厚動物模型研究進展△

吳立康，陳 煜，宋國強，許 鵬

（1.常州大學藥學院醫學院，江蘇常州2131642；2.山東中醫藥大學，山東濟南250355；3.海軍軍醫大學長征醫院脊柱二科，上海200003）

黃韌帶連接各椎體，起保護脊髓神經的作用。當黃韌帶肥厚（ligamentum flavum hypertrophy，LFH)后，壓迫硬膜囊和神經根導致患者出現下肢麻木或間歇性跛行的癥狀。建立可靠的動物模型對黃韌帶肥厚的發病機制研究具有促進作用，也可體內驗證新開發的治療方法。黃韌帶肥厚屬于慢性退變性疾病，造模耗時長且個體間差異大給實驗研究增加難度［1］。近年來，國內外關于黃韌帶肥厚動物模型的制作方法多樣，本文總結這些制作方法的進展，為進一步研究提供思路。

1 黃韌帶肥厚的變化

影像學分析中，正常的黃韌帶組織厚度應在4 mm以下，超過5 mm可判斷為黃韌帶肥厚。正常的黃韌帶是一種結締組織，主要由彈性纖維（80%）和膠原纖維（20%）組成。隨著黃韌帶的退變，組織肥大，表現為彈性纖維丟失和膠原纖維增多并沉積，具有纖維化病變的特征［2］。引起黃韌帶纖維化的原因復雜，小關節和椎間盤退變是最直接的因素。小關節退變導致椎間序列不穩定，黃韌帶受到異常的機械應力刺激［3］。長期的機械應力刺激引發組織微損傷和慢性炎癥的產生，炎癥因子的釋放促使組織過度修復進而產生纖維化。纖維化是黃韌帶肥厚的重要病理因素［4］，如果不能有效控制纖維增生，則會導致結締組織在細胞外基質(extracellular matrix,ECM)大量沉積，成纖維細胞大量增殖，最終引起彈性纖維減少，膠原沉積增加。

在黃韌帶肥厚的過程中，多種分子表達異常。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的表達增加，并刺激Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達增加［5］。肥厚的黃韌帶組織中毛細血管明顯增多，血管生成素樣蛋白2和血管內皮細胞生長因子表達增加［6］。這些因素共同作用，促進了成纖維細胞活化，最終引起黃韌帶肥厚［7］。

2 動物模型建立的方法

近年來多個動物模型模擬了黃韌帶肥厚的病理變化，考慮到經濟成本及實驗難度，實驗動物以實驗兔和實驗鼠為主，模型重復性好，且生理與解剖特征與人相似。

相較于四足站立或俯臥態，雙足站立姿勢會使脊柱承受的壓力增加，引起脊椎退變。有限元分析顯示，直立姿態下，腰椎黃韌帶韌帶受到的應力明顯高于伸展狀態。Zheng等［8］利用小鼠的恐水誘導它們采取兩足站立姿勢，將小鼠置于類似燒杯的空間，底部有水，每天站立6 h。并對站立姿態的小鼠進行mi?cro-CT掃描，檢查脊柱的變化。造模10周后，對黃韌帶面積、彈力纖維/膠原纖維比值和細胞因子受體樣因子1（cytokine receptor like factor 1,CRLF1）的表達進行定量。雙足站立使腰椎黃韌帶受力增加，引起黃韌帶肥厚。組織學分析，實驗組小鼠的黃韌帶中，彈性纖維減少，膠原纖維和纖維化因子表達增加。該團隊還發現，CRLF1表達增加與黃韌帶肥厚具有重要關系，在CRLF1敲除的小鼠中，雙足站立實驗組卻不會刺激肥厚。黃韌帶肥厚是慢性疾病，久坐和不良坐姿會很大程度提高黃韌帶肥厚的發病率。通過模擬人類站立的姿勢，可造成黃韌帶受到的擠壓或牽拉應力增加。該方法使用的工具簡單，但雙足站立姿勢引起的應力不夠明顯，造模效果有待驗證，且樣本間個體差異較大。

為了使黃韌帶受到的機械應力增加，Sato等［9］人為的造成脊柱序列不穩，導致黃韌帶受到異常的應力刺激，從而建立黃韌帶肥厚模型。具體做法為：大鼠腰部后路切開，摘除L5棘突、L4～6棘上韌帶、L4～5、L5～6棘間韌帶。使得大鼠腰椎第5節段與上下段之間的正常平衡被打破，在術后的活動中，由于腰椎后方韌帶被摘除，黃韌帶受到的牽拉力大大增加。8周后處死取材。行EVG（Verhoeff's van Gieson）和Mas?son染色，模型組切片纖維排列規則變差，EVG染色顯示整體區域彈性纖維變少，Masson染色顯示膠原纖維增加，模型組黃韌帶發生纖維化。他們還發現，纖維化在靠近橫突的背側區域更明顯。這說明黃韌帶的背側受到的刺激更明顯，在背側的韌帶更容易發生肥厚。

Hayashi［10］用實驗兔進行黃韌帶肥厚造模，進行L2～3和L4～5后外側植骨融合術，并切除L3～4椎上肌。將機械應力集中在L3～4水平，用來增加L3～4黃韌帶受到的應力刺激。而進行融合的L2～3和L4～5段的黃韌帶則減少受到的應力刺激。術后16周，在機械應力的刺激下，黃韌帶組織中彈力纖維斷裂，軟骨基質增多，與腰椎管狹窄患者的肥大黃韌帶表現相似。該團隊還用DNA芯片進行篩選，實驗組成纖維細胞生長因子9的表達增加，主要集中在黃韌帶末端或小關節周圍，這是黃韌帶退變肥厚的重要原因［11］。在李學朋［12］的研究中，雙醋瑞因能抑制肥厚黃韌帶中炎癥因子的表達，改善纖維化。

通常在黃韌帶肥厚的同時也伴隨一定程度的椎間盤退變。通過后入路切除或破壞脊椎后方肌肉導致黃韌帶受到的機械應力增加容易導致黃韌帶肥厚，而退變的椎間盤導致椎體間序列變差，引起椎間序列不穩也會引起黃韌帶肥厚。卜憲敏等［13］以新西蘭大白兔作為實驗動物，通過頸椎前路穿刺破壞纖維環及抽吸C4/5髓核組織建立兔頸椎不穩動物模型。4周后，C4/5節段黃韌帶纖維排列變差，TGF-β1表達增加。

采用切除椎體之間韌帶的方法可使黃韌帶受到的應力刺激增加，但樣本間差異依舊較大。在動物未處于行走活動的時候，黃韌帶則不受異常的應力刺激。為了使樣本受到的應力刺激量化，減少樣本間差異，Saito［14］制作了一個可固定小鼠的裝置，裝置可電動控制，往復彎曲并強迫小鼠進行牽拉彎腰動作，每日持續3 h。12周后，通過組織學分析，應力牽拉裝置使小鼠黃韌帶增厚，膠原纖維面積，黃韌帶成纖維細胞數量和纖維化相關因子增加。但這種機械應激模型并沒有觀察到巨噬細胞浸潤、血管增加和TGF-β表達增加，而這些變化是人黃韌帶肥厚的標志性變化，該裝置并沒有完全模擬黃韌帶肥厚。

巨噬細胞浸潤是黃韌帶肥厚的重要特征，慢性炎癥引起黃韌帶組織中的巨噬細胞增加，分泌大量炎癥因子和TGF-β1，刺激黃韌帶成纖維細胞增殖分化，最終引起黃韌帶肥厚。Saito團隊［15］通過手術常規暴露小鼠椎體后棘突，鈍性分離椎旁肌，暴露黃韌帶。用30號針對黃韌帶背側進行微損傷，常規縫合。微損傷導致組織內巨噬細胞增加，黃韌帶表現為肥厚，巨噬細胞刺激膠原表達增加，而當注射含有氯磷酸鹽的脂質體清除巨噬細胞可抑制黃韌帶肥大。

溶血磷酸脂酸（lysobisphosphatidic acids,LPA）的高表達可能與黃韌帶肥厚正相關。Zhou［16］將LPA吸附在明膠海綿中，選擇8周雄性SD大鼠，從腰椎L1～2棘突上方作縱向皮膚切口，分離椎旁肌。部分切除相鄰的棘上韌帶和棘間韌帶。用明膠海綿作為載體，負載LPA，插入后外側硬膜外和黃韌帶之間。LPA通過激活LPAR1-Akt信號通路顯著誘導黃韌帶成纖維細胞增殖和抑制凋亡，最終引起黃韌帶肥厚。

黃韌帶的動物模型目前還不算成熟，多種椎間盤退變動物模型的造模思路也可能成為建立黃韌帶肥厚的方法。將小關節突切除引起脊柱不穩，從而導致應力刺激增加，引起脊柱退變、小關節炎癥［17］。此方法實驗的動物黃韌帶組織在應力和炎癥反應下引發退變，但作者并未進行詳細評價，且小關節切除時需把握好量，實際操作時容易直接損傷黃韌帶。TGF-β1是引起黃韌帶肥厚的重要因子［18］，可采用重組TGF-β1蛋白刺激黃韌帶肥厚。這種方法可用于評估治療黃韌帶肥厚的治療方案，尤其是有關TGF-β1參與的信號通路。

3 動物模型的評價方法

影像學檢測：采用MRI可最直觀的觀察黃韌帶的肥厚情況。也可應用CT、X線片等對椎體等骨骼退變的觀察。

動物行為學觀察：黃韌帶肥厚造成腰椎管狹窄影響下肢行動能力，在建立黃韌帶肥厚的動物可進行行為學觀察，如斜板停留實驗，BBB運動功能評分。

分子檢測：對造模后的動物取材，收集黃韌帶樣本。通過PCR或WB分析多種黃韌帶肥厚標志物的表達，如TGF-β1，ColⅠ和Ⅲ等。但這種方法不適用于大鼠或小鼠，由于鼠的脊柱結構較小，其黃韌帶的體積也很小，檢測結果不夠穩定。

組織切片染色：在取材時，很難完整的直接分離出黃韌帶，一般將整個脊柱節段保留。進行組織切片檢查。為了保證結果的準確性，應取相同節段，盡可能選擇相似的位置進行切片。除了HE染色，還可以選擇EVG染色天狼猩紅（sirius red）染色和Masson染色。其中EVG染色是將彈性纖維染成藍黑色，將膠原纖維染成紅色，天狼猩紅染色將膠原纖維染成紅色，Masson是將膠原纖維染成藍色。用軟件對樣本間染色面積進行統計，比較彈性纖維/膠原纖維的比值。此外，切片后還可對ColⅠ、TGF-β1等黃韌帶標志物免疫組化分析。

建立黃韌帶肥厚動物模型的目的在于模擬人類黃韌帶退變肥厚的組織、細胞及分子變化，用于研究黃韌帶肥厚的發生機制。也可以對體外研究的內容在動物體內進行驗證，評價其在組織整體微環境下的適用情況。在上述的黃韌帶肥厚動物模型中，利用黃韌帶受到異常應力刺激，損傷或其他刺激以引起炎癥反應，從而引起動物的黃韌帶肥厚。但也存在一定的問題：（1）實驗結果不穩定；（2）難以全面的模擬人黃韌帶退變肥厚的機制；（3）造模時間長，難度大。黃韌帶肥厚的動物模型建立還處于初步探索階段，黃韌帶肥厚的體內研究亟需一個穩定且高效的動物模型。