冷凍電子顯微鏡觀察人釉原蛋白的自組裝

賴婷婷 陳亮 張川 田鯤

牙釉質作為最堅硬、最精密的硬組織，其形成過程復雜，需基因表達，細胞分泌，蛋白及酶調控等共同作用，構建從分子、納米至宏觀均高度有序的結構。該過程最重要最基礎的是釉原蛋白發生一系列自組裝反應形成納米球，搭建起釉質細胞外基質最基本的結構實體，再進一步聚集成高級構象作為有機模板，指導羥基磷灰石晶體有序地成核與伸長[1]。釉原蛋白(amelogenin)是釉質形成初期最主要的細胞外基質，占90%[1]，在體外能自組裝成直徑16～70 nm的納米球[2]。通過原子力顯微鏡[3]、小角度X線散射(SAXS)[4]、核磁共振[5]、動態光散射(DLS)和透射電子顯微鏡(TEM)[6]等的研究，納米球結構已被廣泛認可。隨著牙釉質礦化成熟，釉原蛋白逐漸降解、消失，即表現為在牙胚發育早期高度表達，晚期及已礦化期低表達甚至無表達。

釉原蛋白的自組裝過程發生在水性環境中，若進行常規脫水會導致蛋白結構明顯改變。冷凍電子顯微鏡能將蛋白樣品迅速冷卻至玻璃態冰[7]，鏡下結構基本反映冷卻前的瞬時狀態，最大程度減少了脫水偽影，且需要的樣品量少[7]。因此，本實驗采用冷凍電子顯微鏡來觀察人釉原蛋白在體外的自組裝過程，初步探究釉原蛋白的自組裝機制，為體外修復缺損釉質提供思路。

1 材料與方法

完整取出青少年下頜第三磨牙牙囊(處于釉質發育期)1 例(四川省人民醫院口腔正畸科)， InvitrogenTMTRIZOL?試劑(賽默飛世爾，美國)提取牙胚細胞總RNA,根據 Gen Bank 公布的人釉原蛋白全長序列(Genebank M86932)，利用 Primer Premier 5 生物學軟件分析并設計特異性引物，引入酶切位點 Bam H I 和 Sac I。引物由上海生工生物公司合成，引物序列如表 1，劃線為酶切位點。逆轉錄合成cDNA鏈,通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增釉原蛋白基因全長序列，并回收、克隆、篩選及鑒定(圖 1)。與pMD19-T原核表達載體構建重組質粒，采用過熱激法再將質粒轉入原核表達菌株宿主菌E.coliTop10 中培養(圖 2)，A600值為0.6時，以0.3 mmol/L異丙基-β- D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導表達、純化，電泳檢測(圖 3)。透析法調pH為3.5，冷凍干燥保存。

在冰上用pH為3.5的超純水溶解釉原蛋白凍干粉， 4 ℃放置24 h，確保蛋白質完全溶解。滴入4 mmol/L pH=8.0的PBS液，使蛋白液pH值從3.5躍升至8.0，蛋白最終質量濃度為0.1 mg/mL。在自組裝發生1、 10、 20 min 時終止反應，觀察組裝情況。將20～50 μL的蛋白溶液滴至銅網多孔碳側，凍干后將銅網置于cryo TEM(Tecnai F20 TEM型，FEI公司，美國)下觀察。

表 1 釉原蛋白全長引物

M: MD2000 Marker; AM:人釉原蛋白

2 結 果

冷凍電子顯微鏡觀察人釉原蛋白在1、 10、 20 min 的自組裝狀態(圖 4)。當pH從3.5迅速提升至8，隨時間遞增，蛋白形態、結構逐漸變化：由最初的低聚體到納米小球，最終形成網狀蛋白框架鏈。該過程是復雜、循序漸進的，兩個單體疊加成二聚體，進一步團聚成六聚體，八聚體等大小不同形狀不同的團聚物[8]。

M: MD2000 Marker; 1: pMD19-T-Am PCR產物

M： Protein maker; 1： 無 IPTG(None IPTG); 2： 0.1 mmol/L IPTG; 3： 0.2 mmol/L IPTG; 4： 0.3 mmol/L IPTG; 5： 0.4 mmol/L IPTG; 6、 7： 誘導前(Before induction); 8、 9： 0.3 mmol/L IPTG誘導后(after 0.3 mmol/L IPTG induction)

隨著聚集體數目的增加、相互融合，出現更大分子量的多聚體與納米球，而納米球串聯形成納米帶，納米帶縱橫交錯形成大面積的網狀蛋白支架。在1 min時主要觀察到蛋白分子的低級結構——低聚體(圖 4左)。蛋白的組裝并非同時進行，同一視野既有單個小體積球體(圖 5A)，也有L型(圖 5B)、蝴蝶夾狀(圖 5C)的四聚體等，體積均相對較小，最長軸直徑 10～40 nm不等，此時發生自組裝的蛋白也較少。10 min時自組裝蛋白明顯增多，體積增大(圖 4中)，低聚體出現環狀或縱向延伸，呈花瓣狀(圖 5D、 5E)、帶狀(圖 5F),同時出現較多的納米球，約20～30 mm(圖 5G)，甚至聚集成直徑約80 nm的巨大的蛋白分子(圖 5H)。 20 min時，蛋白的組裝趨于成熟，小體積的多聚體較少，蛋白在空間三維方向上的延伸明顯(圖 4右),有類似錐體型的結構(圖 5I)，體積明顯變大，形成網狀結構(圖 5J)。

圖 4 釉原蛋白的自組裝過程

1 min(A: 小體積球體; B： L型四聚體； C： 蝴蝶夾狀的四聚體； D： 小花瓣狀); 10 min(E：大花瓣狀； F： 帶狀； G： 納米球； H： 不規則巨大蛋白分子); 20 min(I： 錐體型； J： 蛋白網)

3 討 論

釉原蛋白的結構與功能緊密協作、不可分割。人釉原蛋白由三個不同亞單位組成：N 端具有45 個氨基酸，酪氨酸的含量高，又稱TRAP (tyrosine-rich amelogenin peptide)；中央段具有疏水性，由Xxx-Yyy-Pro重復序列構成(X和Y主要是谷氨酰胺；P，脯氨酸)，變異性大，不同物種氨基酸序列重復單元長度不同；C 端較短，具有親水性，富含亮氨酸。Fukae等[9]提出核-殼模型：中性的N端和中央段形成納米球的致密核心，負極域(C端)暴露于溶液中，形成疏松帶負電荷的殼。適宜條件下，負電荷殼產生排斥力防止納米球之間相互聚集，調節納米球大小。此外，C端還參與羥基磷灰石表面的附著，而N端和中央段主要影響蛋白質之間的相互作用[10]。釉原蛋白的親疏水性，使其在生理條件下微溶于水，呈固態或半固態，易聚集形成團聚物，也為自組裝創造了條件。釉原蛋白轉錄時還可出現RNA 的選擇性剪切，產生富含主要功能區的異構體蛋白片段——LRAP(leucine-rich amelogenin peptide)，其也可自發組裝成納米球[11]。

釉原蛋白作為釉質形成過程中主要的功能性蛋白，屬于內在無序化結構蛋白(intrinsically disordered/unstructured protein family，IDPs)。Goto等[12]研究豬的釉原蛋白認為不同蛋白區域有相應的二級結構，N端 (TRAP) 為 β-sheet；中央段富含展開的聚脯氨酸 II 或 β-turn，如 β- 螺旋；C 末端為不規則螺旋。IDPs構象不穩定，常以非折疊狀態存在，與不同分子相互作用時轉變不同的結構，適宜條件時趨于自組裝成納米球，可以解釋圖中觀察到的大小不等、形態各異的低聚體、多聚體等。釉原蛋白的自組裝受多種因素影響， 包括蛋白質濃度，溫度，pH和離子強度等[13]。本實驗最先觀察到是直徑約10 nm的低聚體(圖 3A)，與實驗[14]提到的3～10 mm大小一致。但未見明顯的單體——直徑小于3 nm的細長結構，猜測釉原蛋白強烈依賴pH，當pH從3躍升至8，觸發了釉原蛋白構象從無序狀態到折疊狀態，自組裝開始，單體迅速消耗聚集成低聚體。低pH時易觀察到單體，如pH=4.4,單體及單體鏈占主體[13]，在酸性溶液中單體呈不對稱的狹長桿狀或橢圓形[15]；低聚體形成后由釉原蛋白N段誘導，中央段通過質子化作用參與納米球的形成，C端對聚合反應的作用較小，主要抑制聚合體尺寸過大[16-17]。納米球形成后，表面暴露多個氨基酸序列(如 ATMP 模體：PYPSYGYEPMGGW)，由于該實驗中缺少非釉原蛋白等物質，不能進一步組裝成超分子集團[18]，納米球大小僅20～30 mm?，F暫無足夠證據表明納米球形態為扁圓形或球形，但傾向于納米球不是均質的,是低聚體圍繞球體空心性排列，呈甜甜圈狀[3，19]。本實驗圖3 DE可能是低聚體正環聚成納米球的過程。 20 min時觀察到的網狀蛋白鏈(圖3J)為非典型的單一軸向蛋白鏈，因為本實驗中蛋白濃度足夠(0.1 mg/ml)，溶液中任一空間點均可發生自組裝，同時由于缺乏非釉原蛋白，如成釉蛋白(ameloblastin)，釉蛋白(enamelin)，蛋白酶以及生長因子類物質等的參與，無法完全模擬體內自組裝環境，最終呈現出較散亂的鏈狀結構。當然，冷凍電子顯微鏡是對三維結構的二維投射，觀察到的平面結構可能與真實結構存在偏差，若需驗證低聚物、納米球、蛋白鏈確切的空間結構及功能，有待進一步探索。

雖然釉原蛋白的自組裝過程已基本達成共識，Moradianoldak實驗發現[20],納米球并非剛性結構，吸附在不同疏水性或不同電荷的表面會解組裝，猜測最終是低聚體亞基在釉原蛋白-礦物質接觸面發揮作用，低聚體才是誘導釉質形成的功能實體。體外已很好地證明了釉原蛋白的逐步分級自組裝，而體內是相當復雜的過程，需綜合考慮礦物質、其他蛋白質、分子間親疏水性等影響裝配過程的各因素?，F如今，牙釉質的仿生礦化被廣泛研究，除釉原蛋白外，有多肽、細胞外基質類似物、聚酰胺-胺型樹枝狀分子及殼聚糖等不斷被提出[21]，但進一步弄清釉原蛋白自組裝機制及功能實體，才是研究新材料及開發新療法修復和再生牙體硬組織的基礎與關鍵。