經皮神經電針刺激對骨質疏松大鼠骨形態發生蛋白-2表達的影響

柏中喜，張 保，喬昱音，王 夢，崔 林

骨質疏松癥是一種以低骨密度和骨組織微結構退化為特征的疾病。臨床表現為髖部、手腕和椎骨骨折，但其他部位也有脆弱性骨折。骨質疏松癥有多因素（遺傳和環境條件相互作用）和多基因性遺傳的特點。因此，骨質疏松癥有所謂的“復雜特征”。雙胞胎和家庭研究表明，50%～80%的骨密度變異是由遺傳因素解釋的[1]。盡管骨折風險也是強遺傳性的，但與骨密度不完全相關，這表明骨密度和骨結構和（或）強度可能是受共同的和獨特的遺傳因素影響。近年來，候選基因已被檢測與骨密度和骨質疏松性骨折的相關性。有研究表明，針刺可以通過改變骨質疏松模型動物的體質量、礦物密度和結構來增強骨強度，其主要激活Wnt-β-連環蛋白信號通路來影響骨形成和代謝，并調節骨保護素和受體活性[2-4]。骨形態發生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）是腫瘤壞死因子蛋白的一種生長因子，它與骨組織代謝密切相關。BMP-2蛋白有誘導成骨潛能，調節軟骨板生長，直接影響成骨過程[5]。本研究旨在探討經皮神經電針刺激對骨質疏松大鼠的治療效果，并從BMP-2方面探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取88只健康的4個月大雌性SD大鼠，平均體質量（260.35±20.44）g。鼠籠溫度保持在（24±2）℃，自由接觸標準大鼠食物和水，大鼠在實驗前1周適應實驗室條件。

1.2 動物分組及骨質疏松大鼠模型構建 手術前，所有大鼠禁食過夜，空白組（22例）不做任何處理；其余大鼠用腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，通過大鼠中線背側切口單獨行雙側剖腹術（假手術組，22例）或雙側卵巢切除術（模型組、電針刺激組，各22例）。假手術組只暴露雙側卵巢但不切除。造模后飼養13周，去卵巢大鼠骨質疏松模型成功建立，對電針刺激組大鼠進行經皮神經電針刺激干預：選取“腎俞”“脾俞”“三陰交”“足三里”穴位，去鼠毛，對針具及穴位進行常規消毒，將不銹鋼毫針（規格：0.35 mm×13 mm）迅速刺入大鼠皮下適當深度，連接電針儀（斷續波，頻率設置2 Hz，刺激強度為1.0 mA），電針刺激每次為15 min，每日1次，連續治療5 d，間隔2日，以21 d為1個療程，共治療3個療程。

1.3 觀察指標 ①離體骨組織骨密度檢測：治療期滿后，處死大鼠，取椎骨、股骨，從靠近植入物頂端3個凹槽的髓骨區域中選擇相同寬度的區域進行取樣。采用雙能X線骨密度儀（OsteoSys公司，韓國）測定大鼠左側股骨及腰椎的骨密度，操作步驟嚴格按照儀器說明書進行。②第4腰椎壓縮實驗：將檢測完骨密度的大鼠椎骨分離出第4腰椎，采用砂紙打磨第4腰椎的上下兩側，使其平整，置于加載平臺上，保持椎體生理方向與加載方向一致；壓頭向下，向標本施加10 mm/min的加載速度，直至大鼠椎體碎裂，記錄并計算最大載荷及彈性模量。③股骨三點彎曲試驗：采用AGS-J系列精密電子萬能材料實驗機測定大鼠左側股骨檢測最大載荷及彈性模量：保持大鼠股骨頭凹面朝下，在跨距17 mm的2個支撐點處放置股骨頭端，壓頭置于股骨長度中間位置上方，向標本施加10 mm/min加載速度，直至大鼠股骨斷裂，記錄并計算最大載荷及彈性模量。④采用改良Mankin評分：采用改良Mankin評分綜合評定大鼠骨組織形態及結構[6]。⑤Real-time PCR檢測大鼠血清BMP-2、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β1, TGF-β1)表達水平：治療期滿后，使用RNeasy迷你試劑盒（上海碧云天公司，中國）分離總RNA。用EcoDry預混試劑盒（Takara株式會社，日本）合成cDNA是的。使用FastStart Universal SYBR Green Master Mix（羅氏公司，瑞士）在Stepone Plus實時PCR系統（應用生物系統公司，美國）進行Realtime PCR。計算BMP2、TGF-β1 mRNA相對值。

1.4 統計學處理 應用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析或者重復測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 離體骨組織骨密度比較 模型組股骨、腰椎骨密度低于空白組及假手術組，電針刺激組高于模型組、低于空白組及假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）；空白組與假手術組間差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 4組骨質疏松大鼠離體骨組織骨密度比較

2.2 第4腰椎壓縮試驗結果比較 第4腰椎壓縮試驗結果顯示，模型組彈性模量、最大載荷低于空白組及假手術組，電針刺激組高于模型組、低于空白組及假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）；空白組與假手術組間差異無統計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2 4組骨質疏松大鼠第4腰椎壓縮試驗結果比較

2.3 股骨三點彎曲試驗結果比較 股骨三點彎曲試驗結果顯示，模型組彈性模量、最大載荷低于空白組及假手術組，電針刺激組高于模型組、低于空白組及假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）；空白組與假手術組間差異無統計學意義（P＞0.05）（表3）。

表3 4組骨質疏松大鼠股骨三點彎曲試驗結果比較

2.4 Mankin評分比較 模型組Mankin評分高于空白組及假手術組，電針刺激組低于模型組、高于空白組及假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）；空白組與假手術組間差異無統計學意義（P＞0.05）（表4）。

表4 4組骨質疏松大鼠Mankin評分比較

2.5 血清BMP-2水平比較 模型組受試大鼠血清BMP-2 mRNA相對值低于空白組及假手術組，電針刺激組高于模型組、空白組及假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）；空白組與假手術組間差異無統計學意義（P＞0.05）（表5）。

表5 4組骨質疏松大鼠血清BMP-2水平比較

2.6 血清TGF-β1表達水平比較 模型組受試大鼠血清TGF-β1 mRNA相對值低于空白組及假手術組，電針刺激組高于模型組、空白組及假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）；空白組與假手術組間差異無統計學意義（P＞0.05）（表6）。

表6 4組骨質疏松大鼠血清TGF-β1表達水平比較

3 討論

骨質疏松癥是根據《黃帝內經》中的中醫理論，被認為是腎氣不足引起的一種衰老和退行性疾病，從2000年前開始，針灸和草藥被廣泛應用于治療。中醫的角度上，疾病是由于人體生命能量“氣”的流動停滯所致；穴位針刺刺激有助于恢復流動，進而促進氣的穩態，使身體功能恢復正常，幾乎所有的中醫院都采用針灸治療骨質疏松癥[7-8]。與其他常規干預比較，針灸被認為是一種相對簡單、廉價和安全的非藥理學的治療方法；然而，由于患者害怕針刺帶來的疼痛和壓力，不愿意接受針灸治療。因此，電針刺激正逐漸成為針灸的替代品。電針刺激是一種有趣的低水平激光療法，是一種無創的光療法，被定義為低強度、非熱激光照射對傳統穴位的刺激[9-11]。治療的無創性和無痛性使得它有助于為患者提供全面的醫療保健。盡管使用低水平、非熱激光照射而不是針刺，但它與傳統針刺的原理相同，并證明其生物效應與針刺相同。電針刺激作為一種低水平激光照射刺激穴位的干預手段，被認為是改善骨縱向生長的一種干預手段[12-13]。本研究采用經皮神經電針刺激對骨質疏松大鼠進行干預，發現治療3個療程后，實驗大鼠骨密度、腰椎及股骨生物力學指標、Mankin評分均明顯提升，證實經皮神經電針刺激治療為有效治療手段。

根據目前的骨骼生物學知識選擇，許多候選基因已經被測試與骨密度和骨質疏松癥有一定的相關性。BMP-2是位于染色體20p12上的生長因子，屬于TGF-超家族[14]。BMP-2在早期胚胎發生、骨骼發育和位于成熟骨骼中的成骨細胞分化中起著關鍵作用。BMP-2的信號傳導需要BMP-2分子與位于成骨細胞表面的BMP受體結合。BMPRS磷酸化細胞內蛋白可影響細胞內Smads信號和轉錄。BMP-2是骨發育和修復的關鍵介質，是骨折愈合的獨特要求。BMP-2在啟動和調節骨形成中的中心作用使得BMP-2表達水平與骨質疏松癥有關的發現是合理的[15-17]。BMP-2基因也與骨關節炎有關，骨關節炎與骨質疏松癥有著復雜的遺傳關系。轉基因小鼠和人類疾病的基因調控證實了了在骨和軟骨形成和成人骨平衡過程中控制BMP信號水平的重要性[18-19]。歸根結底，BMP-2在特定組織中的濃度至關重要，因為改變的水平可能導致發育異?；蛴绊懜鞣N人類疾病的發病或進展。由此可以推斷，檢測體內BMP-2表達水平有助于疾病的診療及預后評估。為探討經皮神經電針刺激治療骨質疏松大鼠的作用機制，本研究采用RT-PCR測定大鼠血清BMP-2、TGF-β1表達水平，發現治療期滿后，電針刺激組大鼠血清BMP-2、TGF-β1 mRNA相對值明顯升高，推斷經皮神經電針刺激治療骨質疏松可能是通過上調血清BMP-2表達水平實現的[20]。

綜上所述，經皮神經電針刺激可能通過提高骨質疏松大鼠血清BMP-2表達水平，增強骨密度，可有效抑制骨質疏松與關節軟骨退化。