Aha1 基因過表達對黑色素瘤細胞凋亡的影響

蔣智文，謝汶蓉，王 悅，劉新光，4，孫雪榮* （1.廣東醫科大學衰老研究所，廣東東莞 523808；2.廣東省醫學分子診斷重點實驗室，廣東東莞 523808；3.廣東醫科大學東莞科研中心，廣東東莞 523808;4.廣東醫科大學生物化學與分子生物學研究所，廣東湛江 524023）

AHA1(activator of heat shock 90kDa protein ATPase homolog 1) 為Hsp90 的協調分子伴侶，對激活Hsp90的ATPase 的活性至關重要[1]。研究發現，Hsp90 在惡性黑色素瘤患者的血清及惡性黑色素瘤組織中的表達明顯上調[2-3]，并且高表達的Hsp90 已經成為黑色素瘤一種重要的分子標記[4]。使用Hsp90 蛋白的抑制劑抑制腫瘤細胞的增殖時，AHA1 的表達量卻持續上調[5]，表明AHA1 的表達可能也與腫瘤的發生發展相關。有研究發現，AHA1 在骨肉瘤細胞中呈高表達[6]，并且Aha1基因的表達可以調節骨肉瘤細胞的增殖和細胞周期[7]。我們前期的研究結果表明，Aha1基因的表達參與調節惡性黑色素瘤細胞的增殖與細胞周期[8]，但是Aha1基因在黑色素瘤的形成過程中的作用尚未明了。本研究旨在研究Aha1基因是否參與黑色素瘤的形成以及對黑色瘤細胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

B16F10 細胞購自中國科學院上海細胞庫，無特定病原體(SPF)級C57BL/6 小鼠購自中山大學實驗中心。細胞培養基DMEM 和血清FBS 購自Gibco 公司。pCMV-HA 與pCMV-HA-AHA1 真核表達載體為本實驗室前期自行構建的質粒。TRIzol 和LipofectamineTM3000 購 自Invitrogen 公司，PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉錄試劑盒購自TaKaRa 公司，熒光定量PCR 試劑TransStart Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物。RIPA 裂解液購自北京索萊寶公司，蛋白酶抑制劑Cocktail 購自Thermo Scientific 公司，BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司，甲叉雙丙烯酰胺購自Bio-Rad 公司，TEMED、過硫酸銨、SDS購自Sigma 公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自Millipore 公司，ECL 試劑盒購自Pierce 公司。AHA1抗體(sc-166065) 購自Santa-Cruz 公司，a-Tubulin 抗體(T5168)購自Sigma-Aldrich 公司。CCK8 試劑購自Dojindo 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 使用含體積分數為10%胎牛血清的DMEM 培養基，在體積分數為5%CO2、37 ℃的細胞培養箱中對B16F10 細胞進行培養。

1.2.2 建立小鼠黑色素瘤B16F10 細胞移植瘤模型

以胰酶消化培養B16F10 小鼠黑色素瘤細胞后，使用PBS 重懸B16F10 細胞并進行計數，制備5×107個細胞的懸液。然后在SPF 級C57BL/6 小鼠的皮下注射0.1 mL 的B16F10 細胞懸液(即5×106個細胞)。每次接種5 只小鼠。觀察并記錄接種B16F10 細胞后的C57BL/6 小鼠身體質量、成瘤時間和腫瘤大小等信息。

1.2.3 小鼠黑色素瘤和瘤旁組織的收集 C57BL/6小鼠成瘤14 d 后，脫頸處死小鼠后，解剖取出小鼠黑色素瘤和瘤旁組織，然后立即浸入液氮罐進行速凍。速凍后立即分別提取組織的mRNA 和總蛋白質，或將速凍后的黑色素瘤和瘤旁組織凍存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.4 小鼠黑色素瘤和瘤旁組織中總mRNA 和總蛋白質的提取 取液氮速凍的小鼠黑色素瘤和瘤旁組織，以研磨機進行研磨后，用TRIzol 試劑提取組織中的總RNA，然后以PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉錄試劑將mRNA 逆轉錄成cDNA，置于-20 ℃冰箱中保存備用；使用RIPA(添加蛋白酶抑制Cocktail) 裂解研磨后的小鼠黑色素瘤和瘤旁組織，再采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定提取組織中的總蛋白，立即進行SDS-PAGE，或-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2.5 定量PCR 使用Aha1的引物(上游5′-CAG AGGGACACTTTGCCACCA-3′，下 游5′-CTCGACCTT CCATGCACAGCT-3′)，內參β-Actin 基因的引物(上游5′-TGCGTGACATTAAGGAGAAGC，下 游5′-AGGAAG GAAGGCTGGAAGAG-3′)，進行定量PCR，測定Aha1基因在小鼠黑色素瘤和瘤旁組織中的mRNA 水平。

1.2.6 免疫印跡檢測 配制12%分離膠后，將測定濃度后并蛋白變性后的蛋白質加入濃縮膠中，行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結束后進行濕法轉膜，轉膜后的PVDF 膜使用5%脫脂奶粉在室溫條件下進行封閉，然后加入一抗于4 ℃條件下孵育過夜，TBS+1‰ 吐溫洗3 次，加入二抗并于室溫條件下孵育1 h，再用TBS+1‰ 吐溫洗3 次，最后ECL 化學發光液，于Azure Biosystems C400 凝膠成像系統曝光拍照。結果使用mage J 進行灰度值分析，實驗至少重復3 次。

1.2.7 細胞增殖檢測 取對數生長期的B16 細胞接種至96 孔板，每組設4 個復孔。繼續培養24 h，待細胞貼壁后，使用LipofectamineTM 3000 試劑，遵照操作說明分別轉染空載體pCMV-HA(對照組)和AHA1的過表達載體pCMV-HA-AHA1(實驗組)。繼續培養48 h 后，每孔分別加入10 μL 的CCK8 試劑，然后轉移至細胞培養箱繼續培養1 h 后，使用多功能酶標儀測定細胞在450 nm 處的吸光度。

1.2.8 AnnexinV-FITC/PI 雙染檢測細胞凋亡 取對數生長期的B16 細胞制成5×105個/mL 單細胞懸液，取2 mL 接種于6 孔板中。繼續培養24 h 后，使用LipofectamineTM 3000 試劑分別轉染空載體pCMVHA(對照組)和AHA1 的過表達載體pCMV-HAAHA1(實驗組)。轉染48 h，使用胰酶消化細胞，2 000 r/min離心10 min 后，經PBS 漂洗，再用1×Binding Buffer，重懸細胞至1×106個/mL。取細胞懸液100 μL 至流式管中，按AnnexinV-FITC/PI 試劑盒操作說明，依次加入FITC-Annexin V 和PI 溶液，室溫避光孵育30 min 后，使用BD FACS CantoⅡ流式細胞儀(BD，USA)進行檢測。最后使用FlowJo 7.6 軟件對細胞凋亡的結果進行分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 Aha1 基因在黑色素瘤及瘤旁組織中的表達

提取小鼠黑色素瘤及瘤旁的組織后，分別提取RNA 后，采用qRT-PCR 的方法檢測發現，小鼠黑色素瘤旁的組織中Aha1基因的mRNA 水平約為黑色素瘤中的2 倍(圖1a);提取小鼠黑色素瘤及瘤旁組織，然后分別提取組織中的蛋白，采用免疫印跡的方法檢測發現，黑色素瘤旁中的AHA1 蛋白顯著高于黑色素瘤組織(圖1b)。上述結果表明，黑色素瘤中Aha1基因的表達顯著低于黑色素瘤旁的組織中的表達。

圖1 Aha1 基因在黑色素瘤及瘤旁組織中的表達

2.2 AHA1 過表達對黑色素瘤B16F10 細胞增殖的影響

在B16F10 細胞中，AHA1 過表達48 h 后，B16F10細胞在450 nm 處的吸光度為0.44±0.08，而轉染pCMVHA 空載體的B16F10 細胞(對照組)在450 nm 處的吸光度為0.26±0.05，差異有統計學意義（P＜0.05)。

2.3 AHA1 過表達對B16F10 細胞凋亡的影響

在B16 細胞中過表達AHA1 蛋白后，流式細胞術檢測得到AnnexinV-FITC/PI 雙染雙變量散點圖。與對照組相比，AHA1 蛋白過表達導致早期凋亡率(Q3)和晚期凋亡率(Q2)明顯上升(如圖2 所示)。AHA1 的過表達導致B16F10 細胞的總凋亡率(Q2+Q3) 顯著增加(P＜0.05)，見表1。

表1 AHA1 過表達對B16F10 細胞凋亡的影響 (±s，n=3)

表1 AHA1 過表達對B16F10 細胞凋亡的影響 (±s，n=3)

與對照組比較:aP＜0.05

圖2 AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測AHA1 蛋白對黑色素瘤B16F10 細胞凋亡的影響

3 討論

惡性黑色素瘤是一種源于黑色素細胞的發病隱匿、侵襲性強、致死率高的高度惡性腫瘤[9]。Hsp90 為黑色素瘤一個重要的分子標記物，在惡性黑色素瘤及普通黑色素瘤細胞高表達[10]，并且Hsp90 蛋白在轉移性黑色素瘤的表達量高于原發性黑色素瘤的表達量[2-4]。AHA1 作為Hsp90 的協同伴侶分子，與Hsp90相互作用后促進Hsp90 蛋白構象的變化進而激活Hsp90 蛋白的ATPase 活性[11]。Aha1表達是否與惡性黑色素瘤的發生相關，目前尚未見文獻報道。但基于AHA1 對黑色素瘤其中一個標記物Hsp90 蛋白的ATPase 活性的激活作用，推測Aha1可能也與黑色素的形成相關。通過比較小鼠黑色素瘤與瘤旁組織中Aha1基因的表達，我們發現Aha1基因在黑色素瘤中的表達顯著低于相應瘤旁組織。Aha1基因在膀胱癌、結腸癌、肝癌和肺癌等腫瘤中的表達顯著高于相應的正常組織；然而Aha1基因在皮膚癌、卵巢癌和子宮癌中的表達明顯低于相應的正常組織[12]。另據相關文獻報道，抑癌基因TP53 在惡性黑色素瘤中只有10%～20% 存在突變，而在肺癌和結腸癌等腫瘤中存在高達80%～90%的突變[13]。這些研究結果表明，Aha1基因在不同腫瘤細胞中的作用可能不盡相同，并且Aha1基因在黑色素瘤中的作用可能與在皮膚癌、卵巢癌和子宮癌中的作用更相似，即低表達的Aha1基因更有利于惡性黑色素瘤的形成。

在黑色素瘤細胞中過表達Aha1基因，我們發現黑色素瘤細胞的生長受到抑制，細胞周期被組織在G1 期[8]，并且促進黑色素瘤細胞的凋亡。我們注意到，Aha1基因在骨肉瘤細胞中高表達，抑制骨肉瘤細胞中Aha1基因的表達，導致更多的骨肉瘤細胞進入細胞凋亡程序[7]。表明Aha1在惡性黑色素瘤與骨肉瘤中的作用迥異。高表達的Aha1可能有利于骨肉瘤的形成；而在惡性黑色素瘤中，高表達的Aha1通過促進黑色素瘤的凋亡，抑制黑色素瘤細胞的增殖，進而抑制黑色素瘤的形成?？傊?，本研究發現高表達的Aha1能夠通過抑制黑色素瘤的生長，促進黑色素細胞的凋亡，進而抑制黑色素瘤的形成。然而Aha1在惡性黑色素瘤中的分子機理還有待更進一步的研究。