電離輻射促進神經膠質瘤細胞初級纖毛發生

馬 偉 馬青龍 魏 麗 華君瑞 何進鵬 王菊芳

1（中國科學院近代物理研究所 甘肅省空間輻射生物學重點實驗室 蘭州730000）

2（中國科學院大學 北京100049）

3（蘭州大學基礎醫學院 蘭州730000）

4（甘肅省人民醫院檢驗科 蘭州730000）

初級纖毛（Primary cilia）是一種源于基體（母中心粒特化結構）、以微管為基礎的突出于細胞膜表面的“毛狀”細胞器，存在于絕大多數哺乳動物細胞中。初級纖毛是細胞感知胞外物理、化學和生物信號的關鍵細胞器，介導多種信號通路的激活和轉導［1-2］，其發生過程受嚴密的細胞周期調控［3］。早期研究發現，在多種類型腫瘤細胞及實體瘤組織中均有初級纖毛缺失現象，推測初級纖毛缺失與腫瘤細胞周期失控相關［4-6］。然而，近期研究不但報道宮頸癌及胃腸道間質瘤等腫瘤細胞具有初級纖毛［7-8］，而且發現初級纖毛與腫瘤化療抵抗密切相關［9］，提示初級纖毛可能在調控腫瘤細胞的應激響應進程中發揮重要作用。

電離輻射（Ionizing radiation，IR）會引起DNA 損傷，導致染色體畸變和中心粒過度復制等基因組不穩定現象［10］。目前，有報道證實紫外線和γ射線照射會促進人成肌細胞、上皮細胞等正常細胞的初級纖毛發生率升高［11-13］。然而，電離輻射是否影響腫瘤細胞初級纖毛的發生和生長，及初級纖毛是否影響腫瘤細胞對電離輻射的應激響應仍未見報道。人神經膠質瘤細胞系（M059K 和M059J）來源于同一神經膠質瘤患者，然而這兩種細胞對DNA 損傷的敏感性存在較大差異，相關的分子機制仍未完全闡明。本研究以M059K 和M059J為研究對象，采用X射線和碳離子束進行照射處理，通過免疫熒光、RNA 干擾及細胞克隆等方法研究電離輻射對神經膠質瘤細胞初級纖毛發生及初級纖毛對細胞電離輻射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人神經膠質瘤細胞系M059K 和M059J 購自美國模式培養物集存庫（American type culture collection，ATCC）；DMEM/F-12 培養基購自美國GIBICO公司；胎牛血清購自以色列BI公司；青霉素及硫酸鏈霉素購自美國Sigma 公司。Arl13b（ADP ribosylation factor-like 13b）一抗購自美國Proteintech公司，γ-Tubulin（γ-Tub）一抗購自美國Sigma 公司，熒光二抗（Alexa Fluor 594 和Alexa Fluor 488）購自美國ThermoFisher 公司，IFT88 基因 siRNA （siIFT88， 序 列 為 ： 5′-GAAGAAAGCUGUAUUGCCAAUAGUU-3′ ， 3′-AACUAUUGGCAAUACAGCUUUCUUC-5′ ） 、siRNA 陰性對照（Negative control，NC）及轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養

M059K和M059J細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/mL 青 霉 素 和100 μg/mL 硫 酸 鏈 霉 素 的DMEM/F-12完全培養基中，并于5%CO2、飽和濕度的37 ℃恒溫培養箱中培養。

1.3 細胞照射

細胞培養至對數生長期后進行照射處理。X射線由PXI Precision X-RAY225照射系統產生，電壓為225 kV，電流為13.3 mA，劑量率為2 Gy/min；碳離子束由中國科學院蘭州重離子加速器（Heavy ion research facility in Lanzhou，HIRFL）淺層治療終端提供，能量為80 MeV/u，傳能線密度（Linear energy transfer，LET）為30 keV/μm，劑量率為2 Gy/min。

1.4 初級纖毛免疫熒光檢測

通過對Arl13b和γ-Tub進行免疫熒光染色指征初級纖毛和基體。其中，Arl13b 屬于小GTP 酶家族，特異定位在初級纖毛膜上［14］；γ-Tub是中心粒結構蛋白［15］。細胞經不同劑量的X 射線或碳離子束照射處理并繼續培養24～72 h，利用4%多聚甲醛室溫固定10 min后，使用含0.5%Triton X-100的磷酸鹽緩沖液（PBS）透膜5 min，然后用含5%山羊血清的PBS 室溫封閉2 h，之后用Arl13b（1∶500）和γ-Tub（1∶500）一抗孵育2 h，熒光二抗（1∶500）室溫避光孵育2 h，使用含0.5%Tween-20 的PBS 洗 片 并 使 用DAPI（4'，6-diamidino-2-phenylindole）封片。熒光顯微鏡采集圖片并進行統計分析，隨機統計15 個以上視野（不少于500個細胞）。利用ImageJ 軟件測量100 個以上初級纖毛長度并計算平均長度。

1.5 初級纖毛干擾

利用siRNA敲低纖毛轉運蛋白IFT88的表達抑制初級纖毛發生。將siIFT88 與Lipofectamine 2000共轉染細胞，5 h后更換新鮮培養基并繼續培養24 h，固定細胞進行免疫熒光染色，觀察和統計初級纖毛發生率及長度，以判斷初級纖毛抑制效率。

1.6 細胞克隆形成

以照射至吸收劑量2 Gy 時細胞的相對存活率（Survival fraction at 2 Gy，SF2，以變量fS2表示）征細胞的輻射敏感性。細胞轉染siIFT88 或陰性對照NC后分別進行X射線或碳離子束照射至吸收劑量2 Gy。消化細胞，取適量細胞（X射線組為1 000個，碳離子組為2 000個）接種于60 mm的培養皿中，置于培養箱中培養12 d，75%乙醇固定5 min后用0.5%結晶紫染液染色3 min，大于50 個細胞的集落視為有效克隆。

克隆形成率=有效克隆數/接種細胞數×100%。

fS2=照射后形成的克隆數/（照射前種植細胞數×未照射細胞的克隆形成率）。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 神經膠質瘤細胞初級纖毛檢測

利用免疫熒光技術標記Arl13b和γ-Tub指征初級纖毛的位置和形態，檢測了人神經膠質瘤細胞M059K 和M059J 初級纖毛表達情況。結果顯示：M059K和M059J均具有初級纖毛（圖1（a）），但兩種細胞的初級纖毛發生率明顯不同，M059K 初級纖毛發生率為(41.36±4.75)%，而M059J 僅為(8.07±1.58)%（圖1（b））。此外，兩種細胞初級纖毛平均長度都超過3 μm，而M059K的初級纖毛平均長度要高于M059J（圖1（c））。以上結果表明神經膠質瘤細胞具有初級纖毛結構，但初級纖毛的發生率和平均長度在不同細胞間存在差別。

圖1 神經膠質瘤細胞M059K和M059J初級纖毛發生率和長度檢測：（a）M059K和M059J初級纖毛免疫熒光圖像（白色箭頭指示初級纖毛，Arl13b（紅色）表示初級纖毛，γ-Tub（綠色）表示基體，DAPI（藍色）表示細胞核，彩色見電子版）；（b）M059K和M059J細胞初級纖毛發生率；（c）M059K和M059J初級纖毛平均長度；**p＜0.01，M059J vs.M059KFig.1 Detection of the primary cilia incidence and length in glioblastoma M059K and M059J cells:(a)representative immunofluorescence images of the primary cilia in M059K and M059J(white arrows indicate primary cilia,primary cilia were stained for Arl13b(red)and γ-Tub(green),and the nuclei were stained with DAPI(blue),color online);(b)quantification of the ciliated cells in M059K and M059J;(c)quantification of primary cilia length in M059K and M059J;**p＜0.01,M059J vs.M059K

2.2 初級纖毛發生率與細胞輻射敏感性的相關性

近期研究發現［9］，化療藥物耐受的肺癌細胞株初級纖毛發生率顯著升高，表明初級纖毛參與調控細胞的DNA 損傷應激響應進程，推測初級纖毛與細胞的電離輻射應激響應及輻射敏感性相關。利用X 射線和碳離子束分別對M059K 和M059J 細胞進行不同劑量照射并檢測細胞相對存活率（圖2）。

圖2 初級纖毛發生率影響神經膠質瘤細胞輻射敏感性：（a）不同劑量X射線照射下M059K和M059J的細胞存活率；（b）不同劑量碳離子束照射下M059K和M059J的細胞存活率；*p＜0.05,**p＜0.01,and***p＜0.001,M059J vs.M059KFig.2 Incidence of primary cilia affects the cellular sensitivity to IR in glioblastoma:(a)cellular survival fraction of M059K and M059J cells exposed to X-ray irradiation at different doses;(b)cellular survival fraction of M059K and M059J cells exposed to carbon ion irradiation at different doses;*p＜0.05,**p＜0.01,and***p＜0.001,M059J vs.M059K

結果顯示，經X 射線或碳離子束照射后，M059K 和M059J 細胞的相對存活率均隨吸收劑量增大而顯著降低，并且碳離子束對細胞的殺傷效果更為顯著，而相同吸收劑量處理時，M059K 的相對存活率均明顯高于M059J，表明初級纖毛發生率低的M059J 細胞較初級纖毛發生率高的M059K細胞對電離輻射（X射線和碳離子束）更敏感。結合M059K 和M059J 細胞初級纖毛發生率的不同（圖1），以上結果提示神經膠質瘤細胞初級纖毛發生率與細胞電離輻射敏感性之間可能存在負相關性。

2.3 X射線影響神經膠質瘤細胞初級纖毛發生

電離輻射能夠促進正常細胞初級纖毛的發生［12-13］，但電離輻射是否影響腫瘤細胞初級纖毛的發生和功能仍不清楚。對M059K 和M059J 細胞進行不同劑量X 射線照射處理，并在照射后24 h利用免疫熒光法檢測Arl13b和γ-Tub的表達，結果顯示X 射線照射同樣具有誘導M059K 細胞初級纖毛發生的作用，且初級纖毛發生率隨著吸收劑量的增加逐漸提高，當劑量為10 Gy時，初級纖毛發生率已接近60%（圖3（a））。此外，初級纖毛發生率還與照射處理后檢測時間點相關，10 Gy X射線照射后72 h 時，M059K 細胞的初級纖毛發生率進一步升高至（78.40±2.28）%。然而，M059J 細胞初級纖毛發生率在X 射線照射前后無明顯變化（圖3（a））。值得注意的是，隨著吸收劑量的增加，M059K 細胞中多纖毛細胞和異常結構纖毛細胞的比例明顯升高（圖3（b）），提示X射線引起的初級纖毛發生和纖毛結構異?？赡芘cM059K 細胞較高的輻射耐受能力相關。以上結果表明，X射線能促進M059K 細胞纖毛發生，并且X 射線誘導初級纖毛發生的作用具有劑量和時間效應。

圖3 X射線對M059K細胞初級纖毛發生的影響：(a)不同劑量X射線照射M059K和M059J細胞后的初級纖毛發生率；(b)X射線照射后M059K的多纖毛細胞免疫熒光圖像（Arl13b（紅色）表示初級纖毛，γ-Tub（綠色）表示基體，DAPI（藍色）表示細胞核，彩色見電子版）；*p＜0.05,照射組vs.對照組Fig.3 Effects of X-ray on ciliogenesis in M059K cells:(a)quantification of the ciliated cells in M059K and M059J cells exposed to X-ray irradiation;(b)immunofluorescence images of multi-ciliated cells in M059K cells exposed to X-ray irradiation(primary cilia were stained for Arl13b(red)and γ-Tub(green),and the nuclei were stained with DAPI(blue),color online);*p＜0.05,ionizing radiation group vs.control group

2.4 初級纖毛調控神經膠質瘤細胞的輻射敏感性

上述結果證實初級纖毛與神經膠質瘤細胞輻射敏感性相關，且電離輻射能夠促進M059K 細胞初級纖毛發生，然而初級纖毛是否具有調控M059K細胞的輻射敏感性的功能仍未明確。目前，通常采用siRNA技術敲低IFT88基因表達達到干擾初級纖毛發生的效果［16］。M059K細胞轉染siIFT88后，免疫熒光結果顯示，抑制IFT88基因表達能有效降低X 射線引起的初級纖毛發生，且初級纖毛平均長度明顯變短（圖4（a））。以SF2 評估M059K 細胞的電離輻射敏感性，細胞經X 射線或碳離子束照射處理后克隆存活實驗結果顯示（圖4（b）、（c）），轉染siIFT88 干擾初級纖毛發生后與陰性對照相比，細胞SF2 值在X 射線照射時由0.58±0.05 降至0.21±0.04（p＜0.01），在碳離子束照射時由0.37±0.04降至0.19±0.02（p＜0.05），表明靶向初級纖毛能顯著提高M059K細胞的輻射敏感性，同時提示初級纖毛可能參與調控M059K 細胞的輻射敏感性。

圖4 干擾初級纖毛提高神經膠質瘤細胞的輻射敏感性：(a)M059K細胞在siIFT88干擾初級纖毛以及X射線照射后的免疫熒光圖像（白色箭頭指示初級纖毛，Arl13b(紅色)表示初級纖毛，γ-Tub(綠色)表示基體，DAPI(藍色)表示細胞核，彩色見電子版）；(b)siIFT88或NC處理M059K細胞并在2 Gy X射線或碳離子照射下形成的細胞克隆圖像；(c)X射線或碳離子束照射下M059K細胞的SF2定量分析；*p＜0.05，**p＜0.01，siIFT88 vs.NCFig.4 Interference of primary cilia enhances the radiosensitivity of glioblastoma cells:(a)immunofluorescence images of primary cilia treated with siIFT88 in IR-exposed M059K cells(white arrows indicate primary cilia;primary cilia were stained for Arl13b(red)and γ-Tub(green),and the nuclei were stained with DAPI(blue),color online);(b)photographs of colonies formed by M059K cells treated with siIFT88 or NC and exposed to 2 Gy of X-rays or carbon ions irradiation;(c)SF2 of M059K cells exposed to X-ray or carbon ion irradiation;*p＜0.05,**p＜0.01,siIFT88 vs.NC

3 討論

初級纖毛作為細胞的“天線”，通過調控Hedgehog、Wnt、TGF-β、Notch 等多種信號通路感應物理、化學和生物信號刺激，其結構和功能異常會導致一系列疾?。?7-18］，包括腫瘤的發生和發展［19］。一方面，研究發現多種類型的腫瘤細胞缺失初級纖毛［4-6］，通過藥物誘導初級纖毛能有效抑制腫瘤細胞增殖［20］；另一方面，人基底細胞癌等部分類型腫瘤細胞高度依賴于初級纖毛介導的Hedgehog 通路，抑制初級纖毛能夠有效降低細胞活性［21］。此外，在人宮頸癌和胃腸道間質瘤等類型的腫瘤中同樣保留了一定比例具有初級纖毛的腫瘤細胞［7-8］，表明初級纖毛是維持腫瘤細胞功能所必需的重要細胞器。本研究發現，人神經膠質瘤M059K 和M059J 均具有初級纖毛，這與早期神經膠質瘤細胞及組織檢測到初級纖毛的報道結果相一致［22］。然而，初級纖毛在神經膠質瘤細胞中發揮的生物學功能仍有待研究。

電離輻射是否影響腫瘤細胞初級纖毛發生還未見有相關的報道。本研究首次發現電離輻射（X射線和碳離子束）能夠促進神經膠質瘤細胞M059K初級纖毛的發生和延長（圖3（a）），并且隨著輻照劑量的增加多纖毛和異常纖毛細胞比例也相應提高（圖3（b）），這與Filipova等［12］在人成肌細胞C2C12 及Shimada 等［13］在人永生化視網膜色素上皮細胞hTERT-RPE1中獲得的研究結果一致。這些結果證明電離輻射不僅能誘導正常細胞的初級纖毛發生，同樣能促進腫瘤細胞初級纖毛發生，而電離輻射引起初級纖毛發生率的提高在正常細胞和腫瘤細胞中是否會產生相似的生物學效應是值得關注和研究的重要問題。

M059K 和M059J 是來源于同一神經膠質瘤患者 的DNA-PKcs （DNA-dependent protein kinase catalytic subunit）基因狀態不同的兩種細胞系，M059K 為野生型，而M059J 為缺失型［23］。DNAPKcs 屬于PIKK（Phosphoinositide-3-kinase-related protein kinase）家族，是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。PIKK家族是DNA損傷應答和修復的關鍵調節 因 子 ， 包 括 ATM （Ataxia-telangiectasia mutated）、 ATR （Ataxia-telangiectasia and Rad3-related）、DNA-PKcs 及mTOR（Mammalian target of rapamycin）等成員［24］。研究證實ATM、ATR及mTOR均是調控初級纖毛發生的重要因子［25-27］。本研究結果表明，DNA-PKcs 野生型細胞M059K 經電離輻射處理后初級纖毛發生率和長度均顯著提高，而DNA-PKcs缺失型細胞M059J則無明顯變化（圖3（a））。此外，我們前期研究發現部分腫瘤細胞經電離輻射處理后發生G2期長期阻滯并進入衰老狀態［28］，同時伴隨著PIKK 家族下游因子Aurora A、Plk1 等周期調控蛋白的降解［29］，而Aurora A、Plk1 及KIF2 等的降解和激活與初級纖毛的發生及解聚直接相關［30-31］。因此，我們推測在神經膠質瘤細胞中DNA-PKcs同樣是初級纖毛發生和延長所需要的，而電離輻射可能通過激活DNAPKcs 而影響下游Aurora A 和Plk1 等周期調控蛋白的活性，最終導致初級纖毛的發生和延長。

研究普遍認為DNA-PKcs 基因的缺失是造成M059J 細胞輻射敏感性遠高于M059K 細胞的關鍵原因［32］。我們的結果提示初級纖毛發生率的差異同樣影響兩種細胞的輻射敏感性（圖（1）、（2）），并且電離輻射處理時，M059K細胞的初級纖毛發生率進一步提高，而M059J 則無明顯變化（圖（3））。干擾初級纖毛發生能顯著增強M059K的輻射敏感性（圖4（c）），這些結果暗示初級纖毛及其相關的信號通路在調控細胞輻射應激響應及輻射敏感性進程中同樣發揮著重要作用。值得關注的是，Hedgehog 通路的激活高度依賴于初級纖毛［33］，其下游靶基因涉及抗凋亡和激活自噬等多種促進細胞存活的功能［34］。由此推測電離輻射有可能通過促進M059K 細胞初級纖毛發生和延長而異常激活Hedgehog 通路，從而使細胞抵抗電離輻射引發的細胞凋亡提高了存活能力，但具體的機制仍需進一步探索和驗證。

綜上所述，本研究首次揭示了電離輻射影響人神經膠質瘤細胞初級纖毛發生的生物學現象，證明了初級纖毛具有調控腫瘤細胞輻射敏感性的生物學功能，為研究神經膠質瘤在內的腫瘤放療抵抗的分子機制提供了新思路，同時為腫瘤放療增敏提供了新靶點和理論依據。