3種宿主源盾纖毛蟲的分離鑒定及體外培養研究

高延奇，王森，劉娟，黨慧鳳，黎睿君

(大連海洋大學 水產與生命學院，農業農村部北方海水增養殖重點實驗室，大連市海珍品疾病防控重點實驗室，遼寧 大連 116023)

盾纖毛蟲隸屬于纖毛門Ciliophora寡膜綱Oligohymenophorea盾纖目Scuticociliatida[1]。該類纖毛蟲能夠自由生活在海水中，但在魚體受傷、環境惡化等情況下，可引起海水養殖動物感染，主要表現為以宿主細胞或組織為食的組織性寄生蟲，導致養殖動物大量死亡[2]。盾纖毛蟲現已被公認為是海水養殖動物的一類病原體，在亞洲、大洋洲、歐洲和北美洲等地區均已報道魚類嚴重感染盾纖毛蟲的病例，如海洋尾絲蟲Uronemamarinum、水滴偽康纖蟲Pseudocohnilembuspersalinus和貪食邁阿密蟲Miamiensisavidus等，能夠引起大菱鲆Scophthalmusmaximus[3-4]、歐洲舌齒鱸Dicentrarchuslabrax[5]、比目魚Paralichthysolivaceus[6]、海龍Phyllopteryxtaeniolatus[7]、虹鱒Oncorhynchusmykiss[8]、藍鰭金槍魚Thunnusmaccoyii[9]等魚類發病。

本試驗中，從遼寧大連地區養殖的患病刺參、紅鰭東方鲀、大菱鲆體表分離出3種盾纖毛蟲，根據其形態分析，并結合3種盾纖毛蟲的18S rDNA基因序列[10]，構建了相關類群的系統發育樹，從分子序列方面進一步確定了其屬級系統分類地位[11]，在盾纖毛蟲適宜環境生活溫度20 ℃下，篩選了3種盾纖毛蟲體外培養的最適細胞培養基，初步研究了不同溫度、鹽度、pH條件對3種盾纖毛蟲種群生長的影響，旨在為盾纖毛蟲的分離鑒定及基于盾纖毛蟲全蟲疫苗研制的體外培養條件優化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年10月—2017年5月分別從遼寧省大連市某紅鰭東方鲀、大菱鲆和刺參養殖場收集病料，于農業農村部北方海水增養殖重點實驗室對病料進行病原分離。將分離到的蟲體接種于海水肉湯培養基中馴化培養，之后挑取單個蟲體接種于改良過的L-15培養基內純化培養，并在實驗室傳代保種。

1.2 方法

1.2.1 盾纖毛蟲的形態觀察 活體觀察：在干凈載玻片上滴加蟲液，并緩慢蓋上蓋玻片，由低倍鏡到高倍鏡，依次觀察并拍照記錄。

甲醛固定觀察：吸取1 mL蟲液加至1.5 mL的離心管中，吸取少量體積分數為10%的甲醛溶液滴入離心管，搖勻滅活之后，從中吸取蟲液滴在干凈載玻片上，并緩慢蓋上蓋玻片，由低倍鏡到高倍鏡依次觀察并拍照記錄。

甲基綠派洛寧染色觀察：吸取1 mL蟲液加至1.5 mL的離心管中，吸取經離心處理過的甲基綠派洛寧上清染液0.1 mL滴入離心管，搖勻之后，從中吸取蟲液滴在干凈載玻片上，并緩慢蓋上蓋玻片，由低倍鏡到高倍鏡依次觀察并拍照記錄。

醋酸洋紅染色觀察：染色條件及觀察步驟均同甲基綠派洛寧染色觀察，只將甲基綠洛寧液換為等量醋酸洋紅染液(不經離心)。

掃描電鏡觀察：參照王印庚等[12]的步驟。

1.2.2 3種盾纖毛蟲總DNA的提取 對純化后擴大培養的盾纖毛蟲，采用浮游生物計數框計數其種群密度(每次吸取25 μL，計數3次，用平均值±標準差表示)，并加入適量體積分數為10%的甲醛溶液殺死盾纖毛蟲，以4 000 r/min離心10 min，收集5×105個盾纖毛蟲，使用TIANamp Genomic DNA 基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取盾纖毛蟲總DNA。用50 μL滅菌雙蒸水溶解DNA沉淀，于-80 ℃下保存備用。

1.2.3 18S rDNA 基因序列的PCR擴增 選用18S rDNA通用引物，上游引物F:5′AACCTGGTTGATCCTGCCAGT 3′，下游引物R:5′TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC 3′[13]，以提取的盾纖毛蟲總DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系(25 μL)包含：rTaq酶0.25 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，總DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，用ddH2O補足至25 μL。PCR擴增程序：94 ℃ 下預變性 5 min；94 ℃下循環變性1 min， 58 ℃下退火復性2 min，72 ℃下延伸2 min，共進行30個循環；最后在72 ℃下再延伸5 min，4 ℃下結束。取3 μL PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(50×TAE緩沖液，電壓120 V)，DNA 分子量標準使用DL2000，在凝膠成像系統上觀察。

1.2.4 基因克隆與測序 采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)純化回收PCR產物，將純化后的PCR產物直接連接至pEASY-T1載體，轉化到感受態細胞EscherichicoliDH5中，接種于含Amp的LB液體培養基中，震蕩培養5 h，經特異PCR驗證后，將陽性菌株送至北京華大基因研究中心進行DNA測序驗證。

1.2.5 環境因子對3種盾纖毛蟲種群生長的影響試驗

1)培養基的篩選。 在6孔板中分別加入配制好的L-15、RPMI1640和MEM培養基(調節鹽度為30，pH為7.2)，每種培養基設置3個平行，每孔3 mL，再分別接種300個盾纖毛蟲，溫度設置為盾纖毛蟲自然環境生長適宜溫度20 ℃，每天觀察并統計25 μL蟲液中的種群數量(計數3次，取其平均值)，連續觀察統計7d。

2)不同溫度條件下3種盾纖毛蟲種群密度的計數。接種處于種群生長指數期的蟲體于50 mL的錐形瓶中，每個錐形瓶盛入20 mL篩選出的最適細胞培養基L-15培養基，調節鹽度為30，pH為7.2，分別在10、15、20、30 ℃下進行培養，每個溫度設3個平行組，盾纖毛蟲種群初始密度為100 ind./mL，每天觀察并統計25 μL蟲液中的種群數量(計數3次，取其平均值)，連續觀察統計7 d。

3)不同鹽度條件下3種盾纖毛蟲種群密度的計數。接種處于種群生長指數期的蟲體于50 mL的錐形瓶中，每個錐形瓶盛入20 mL的L-15培養基，培養溫度為20 ℃，pH 為7.2，分別在13、20、30和40鹽度下進行培養，每個鹽度設3個平行組，盾纖毛蟲種群初始密度為100 ind./mL，觀察及統計方法同溫度試驗。

4)不同pH條件下3種盾纖毛蟲種群密度的計數。接種處于種群生長指數期的蟲體于50 mL的錐形瓶中，每個錐形瓶盛入20 mL的L-15培養基，培養溫度為20 ℃，鹽度為30，分別在pH為4.2、5.2、7.2、9.2下進行培養，每個pH設3個平行組，盾纖毛蟲種群初始密度為100 ind./mL，觀察及統計方法同溫度試驗。

1.2.6 序列比對與系統進化分析 將測序所得到的3種盾纖毛蟲的18S rDNA序列在GenBank 數據庫中用BLAST進行比對分析，并收集相關的盾纖目纖毛蟲18S rDNA 基因序列，采用Clustalx軟件進行多序列比對。運用MEGA 4軟件采用鄰接法(Neighbor-joining method)構建系統發生樹，并通過自舉分析(bootstrap)進行置信度檢測，自舉數據集為1 000次。

2 結果與分析

2.1 3種盾纖毛蟲的形態學

1)分離自大菱鲆的盾纖毛蟲(TUR-2)形態特征：活體外形為飽滿的水滴狀，呈瓜子形，表膜無缺刻；蟲體頂端略尖，向背彎曲，后端渾圓，周身長有纖毛，排列稀疏(圖1 A～C)，后體部有一條較長的尾纖毛(圖1F)；體內具有多個圓形食物泡，細胞質無色，顯微鏡下有時可見位于中央區的不透明大核，呈圓形；一個明顯伸縮泡，位于體后端。甲基綠派洛寧及醋酸洋紅染色結果顯示，可見明顯大核，位于體中部，為不規則的橢圓形或圓形(圖1D、E)。

A、B—活體觀察；C—甲醛固定觀察；D—甲基綠派洛寧染色觀察；E—醋酸洋紅染色觀察；F—掃描顯微鏡觀察；FV—食物泡；CV—伸縮泡；CC—尾纖毛；Ma—大核。A and B—observation of living ciliate; C—observation of ciliates fixed by formaldehyde; D—methyl green-pyronin method; E—aeto carmine method; F—electron scanning microscope method; FV—food vacuole; CV—contractile vacuole; CC—caudal cilium; Ma— macronucleus.圖1 分離自大菱鲆的盾纖毛蟲TUR-2形態觀察Fig.1 Morphologic observation of scuticociliates TUR-2 isolated from turbot Scophthalmus maximus

2)分離自紅鰭東方鲀的盾纖毛蟲(TFG-1)形態特征：蟲體呈葵花籽形，前半部稍向內側彎曲，頂端形成不明顯的喙狀突起，表膜無缺刻，體內具有多個晶體(圖2A、B)；蟲體周身長有纖毛，蟲體后端有一條長尾纖毛(圖2E)。甲基綠派洛寧及醋酸洋紅染色結果顯示，可見明顯大核，位于體中部，為不規則的橢圓形或圓形(圖2C、D)。

A—甲醛固定觀察；B—活體觀察；C—甲基綠派洛寧染色觀察；D—醋酸洋紅染色觀察；E—掃描顯微鏡觀察；CC—尾纖毛；Ma—大核。A—observation of ciliates fixed by formaldehyde; B—observation of living ciliate; C—methyl green-pyronin method; D—aeto carmine method; E—electron scanning microscope method; CC—caudal cilium; Ma—macronucleus.圖2 分離自紅鰭東方鲀的盾纖毛蟲TFG-1形態觀察Fig.2 Morphologic observation of scuticociliates TFG-1 isolated from tiger putter Takifugu rubripes

3)分離自刺參的盾纖毛蟲(STI-3)形態特征：活體外形穩定，呈典型瓜子形，前半部稍向內側彎曲，頂端裸毛區形成明顯的喙狀突起，呈尖角狀(圖3B);表膜無缺刻，體內具有多個不透明晶體(圖3A、B)，中央區或前端偏上可見大核；蟲體頂端尖，周身遍布纖毛，后端有一條略長的尾纖毛(圖3E)。甲基綠派洛寧及醋酸洋紅染色結果顯示，可見中央區或前端明顯大核，為不規則的橢圓形或圓形，小核不明顯，近球形，緊位于大核側邊(圖3C、D)。

A—活體觀察；B—甲醛固定觀察；C—甲基綠派洛寧染色觀察；D—醋酸洋紅染色觀察；E—掃描顯微鏡觀察；CC—尾纖毛；Ma—大核；Mi—小核。A—observation of living ciliate; B—observation of ciliates fixed by formaldehyde; C—methyl green-pyronin method; D—aeto carmine method; E—electron scanning microscope method; CC—caudal cilium;Ma—macronucleus;Mi—micronucleus.圖3 分離自刺參的盾纖毛蟲STI-3形態觀察Fig.3 Morphologic observation of scuticociliates STI-3 isolated from sea cucumber Apostichopus japonicus

2.2 序列比對與系統進化分析

利用真核生物18S rDNA的通用引物F/R進行PCR擴增，電泳膠圖如圖4所示。測序結果顯示，TFG-1基因片段大小為1 756 bp，TUR-2基因片段大小為1 755 bp，STI-3基因片段大小為1 755 bp。將擴增片段的測序序列在GenBank上進行同源性比對后顯示， TFG-1序列與海洋尾絲蟲Uronemamarinum(GQ259747.1)的一致性高達99%，TUR-2序列與水滴偽康纖蟲Pseudocohnilembuspersalinus(GQ265955.1)的一致性高達99%，STI-3序列與海洋尾絲蟲U.marinum(DQ867074)的一致性高達99%。

M—DL2000 DNA Marker；1～3—TFG-1的18S rDNA條帶；4～6—STI-3的18S rDNA條帶；7～9—TUR-2的18S rDNA條帶。M—DL2000 DNA Marker; 1-3—PCR product of 18S rDNA gene of the TFG-1; 4-6—PCR product of 18S rDNA gene of the STI-3; 7-9—PCR product of 18S rDNA gene of the TUR-2.圖4 18S rDNA通用引物PCR擴增結果Fig.4 Amplification of 18S rDNA gene by PCR

在GenBank 數據庫中，選取17 種不同種屬的纖毛蟲相應序列，采用MEGA 4軟件構建系統進化樹，結果如圖5所示，TFG-1序列與U.marinum(GQ259747.1)以最高置信值(100%)聚為一支；TUR-2 序列與P.persalinus(GQ265955.1)以最高置信值(100%)聚為一支, 再與Mesanophryscarcini(AY103189)以置信度(47%)聚為一支，而與其他種類相距較遠；STI-3序列與U.marinum(DQ867074)以最高置信值(100%)聚為一支。

圖5 基于18S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of the related ciliates based on 18S rDNA sequences

2.3 盾纖毛蟲體外培養基篩選

在盾纖毛蟲適宜環境生活溫度20 ℃下，設置鹽度30、 pH 7.2，開展了3種盾纖毛蟲在不同培養基中的體外培養，結果如圖6所示。從圖6可見：TFG-1、TUR-2 和STI-3均能在L-15、MEM和RPMI1640培養基中生長，且培養4～5 d時，種群密度達到最大值，之后處于穩定期；在生長期，TFG-1、TUR-2 和STI-3在L-15培養基的繁殖速度比在MEM、RPMI1640培養基中快；3種盾纖毛蟲在L-15培養基中生長的最大種群密度也比在MEM、RPMI1640培養基中高，且穩定期較長。

圖6 3種盾纖毛蟲在3種培養基中的生長情況Fig.6 Growth of three species of scuticociliates in the three media

這表明，在20 ℃培養溫度下，3種盾纖毛蟲均能夠在3種細胞培養基中生長，但在L-15細胞培養基中的種群密度顯著高于MEM和RPMI1640培養基。

2.4 溫度對3種盾纖毛蟲種群生長的影響

在鹽度30、pH 7.2條件下，開展了3種盾纖毛蟲在不同培養溫度下的體外培養試驗，結果如圖7所示。10 ℃時，TUR-2能夠分裂增殖，種群密度在第6天時達到最大值，TFG-1和STI-3種群密度較低，未出現明顯增殖(圖7(a))；15 ℃時，TUR-2的種群密度在第5天時達到最大值，STI-3的種群密度在第7天時達到最大值，TFG-1種群密度較低，未出現明顯增殖，TUR-2的種群密度明顯高于STI-3(圖7(b))；20 ℃時，STI-3的種群密度在第4天時達到最大值，TFG-1種群密度在第4天時達到最大值，TUR-2的種群密度在第6天時達到最大值，STI-3的種群密度明顯高于TUR-2和TFG-1(圖7(b))；30 ℃時，STI-3和TUR-2的種群密度均在第5天時達到最大值，STI-3的增長明顯高于TFG-1和TUR-2，TFG-1的種群密度明顯高于TUR-2(圖7(b))。

3種盾纖毛蟲在15、20、30 ℃培養溫度中均能夠生長，隨著溫度的升高盾纖毛蟲呈現出了種群密度增大的趨勢，表明一定范圍內溫度的提升有助于盾纖毛蟲種群密度的增加，但根據本研究中宿主的自然生活溫度，均為低溫養殖動物，最終確定20 ℃用于3種盾纖毛蟲體外培養溫度。

2.5 鹽度對3種盾纖毛蟲種群生長的影響

在溫度為20 ℃、pH 7.2條件下，開展了3種盾纖毛蟲在不同鹽度下的體外培養試驗，結果如圖8所示。初始鹽度為13時，TUR-2的種群密度在第5天時達到最大值，STI-3的種群密度在第5天時開始增加，TFG-1的種群密度較低，不增殖(圖8(a))；初始鹽度為20時，TUR-2 的種群密度在第5天時達到最大值，TFG-1的種群密度在第7天時達到最大值，STI-3的種群密度在第4天時達到最大值(圖8(b))；初始鹽度為30時，STI-3種群密度在第6天時達到最大值，TUR-2種群密度在第7天時達到最大值，TFG-1的種群密度在第5天時達到最大值，STI-3的種群密度明顯高于TUR-2和TFG-1，TUR-2 的種群密度明顯高于TFG-1(圖8(b))；初始鹽度為40時，STI-3的種群密度在第4天時達到最大值，TUR-2的種群密度在第6天時達到最大值，TFG-1的種群密度在第5天時達到最大值，STI-3的種群密度明顯高于TUR-2、TFG-1(圖8(b))。

這表明，在20 ℃培養溫度下，3種盾纖毛蟲均能夠在鹽度為20、30、40的L-15細胞培養基中生長，但在鹽度為30的L-15細胞培養基中的種群密度明顯高于鹽度為20和40的細胞培養基。

2.6 pH對3種盾纖毛蟲種群生長的影響

在溫度為20 ℃、鹽度30條件下，開展了3種盾纖毛蟲在不同pH下的體外培養試驗，結果如圖9所示。初始pH為4.2時，STI-3、TFG-1和TUR-2的種群密度均較低，未出現明顯增殖(圖9(a));初始pH為5.2時, 培養到第4天時, TFG-1種群密度開始增加, 在第7天時達到最大值，培養到第5天時，STI-3種群密度開始增加，STI-3的種群密度在第7天時達到最大值，TUR-2的種群密度較低，未出現明顯增殖(圖9(b));初始pH為7.2時，STI-3和TFG-1的種群密度在第4天時達到最大值，TUR-2的種群密度均在第5天時達到最大值，STI-3的種群密度明顯高于TFG-1、TUR-2(圖9(b))；初始pH為9.2時，TUR-2和STI-3的種群密度均在第5天時達到最大值，TFG-1的種群密度在第6天時達到最大值(圖9(b))。

圖9 3種盾纖毛蟲在pH為4.2、5.2、7.2和9.2時的生長情況Fig.9 Growth of three species of scuticociliates at pH 4.2, 5.2, 7.2 and 9.2

這表明，在20 ℃培養溫度下，3種盾纖毛蟲均能夠在pH為7.2和9.2的L-15細胞培養基中生長，但在pH為7.2的L-15細胞培養基中的種群密度最高。

3 討論

3.1 不同宿主源盾纖毛蟲的分離與鑒定

目前，國內已有紅鰭東方鲀、大菱鲆等海洋動物盾纖毛蟲病的報道，且能夠從同一種宿主上分離出不同種類的盾纖毛蟲，或者同一種類的盾纖毛蟲能夠從多種宿主上分離出來，這表明盾纖毛蟲無明顯的宿主選擇性。高曉田等[14]、張立坤等[15]分離并鑒定出引起牙鲆體表潰爛的寄生蟲為貪食邁阿密蟲Miamiensisavidus和水滴偽康纖蟲P.persalinus。研究表明，蟹棲擬阿腦蟲Paranophrgscarcini不僅能感染中華絨螯蟹[16]，而且能感染人工越冬期的中國對蝦[17]，同時吞食大菱鲆體表組織引起體表潰爛[12]。

本研究中從患病養殖大菱鲆體表潰爛處分離到的病原盾纖毛蟲，與張立坤等[15]分離自養殖牙鲆體表潰爛組織中的盾纖毛蟲，以及宋微波等[18]從養殖對蝦中分離到的盾纖毛蟲，均在形態特征上較為相似。結合18S rDNA序列比對結果，本研究中確定此盾纖毛蟲是偽康纖蟲屬的一種，再次證明了盾纖毛蟲無明顯的宿主選擇性。麻麗丹等[19]從患病養殖紅鰭東方鲀體表分離到的盾纖毛蟲，以及王會芳[20]從紅鰭東方鲀分離到的盾纖毛蟲，均只根據形態特征鑒定病原體為海洋尾絲蟲，而本研究中從形態特征和18S rDNA序列信息兩方面進一步證實了本次引起養殖紅鰭東方鲀體表潰爛的寄生蟲屬于尾絲蟲屬。本研究中同時還從患病養殖刺參潰爛組織中分離到病原，通過形態特征及分子生物學方法確定其也隸屬尾絲蟲屬。

目前，尚未有由尾絲蟲屬寄生引起養殖刺參盾纖毛蟲病的研究報道，本研究在國內屬首次報道，病因可能與刺參的生活習性有關，野生刺參是底棲動物，一般生活在潮流暢通、水質清澈的巖礁底或沙底海域[21]，幾乎不與營腐生盾纖毛蟲接觸，同時刺參生活的低溫環境不利于盾纖毛蟲的大量繁殖，但隨著人工養殖刺參的環境惡化，加劇了盾纖毛蟲病在刺參中傳播的風險，具體原因還需進一步研究。本研究中分離自紅鰭東方鲀的盾纖毛蟲與分離自刺參的盾纖毛蟲均屬于尾絲蟲，但在形態特征上存在較大差異，如吻端大小不同，形體不同等，再結合分子信息，兩者18S rDNA序列存在一個堿基的差異, 推測是否因為宿主不同導致的寄生蟲相應突變, 還需進一步研究證明。

3.2 體外培養基篩選和最佳培養條件篩選

本研究在盾纖毛蟲體外培養基篩選試驗中發現，L-15培養基更適合盾纖毛蟲的體外培養。L-15培養基富含無機鹽、氨基酸和維生素，與MEM、RPMI1640培養基相比，L-15培養基的氨基酸含量更高，高水平的氨基酸對體外培養盾纖毛蟲的生存和繁殖很重要。本試驗結果與Iglesias 等[22]的研究結果相同。雖然本試驗中已在L-15培養基里添加了一定量的青霉素和鏈霉素，可抑制絕大多數的細菌，但后續試驗中發現，培養基里還有少量細菌，通過藥敏試驗篩選出了最佳的抗生素是諾氟沙星，因此，可以在培養基里添加適當的諾氟沙星，以進一步抑制細菌滋生。

此外，本研究在實驗室不同溫度、鹽度和pH條件下對3種盾纖毛蟲種群密度的影響試驗中發現，在更接近盾纖毛蟲自然環境溫度20 ℃條件下，鹽度為30、pH為7.2時，3種盾纖毛蟲的種群密度相對較高，且維持時間較長，這與張立坤等[23]研究貪食邁阿密蟲在實驗室的培養結果相吻合。

4 結論

1)本研究中從刺參和紅鰭東方鲀體表分離出的盾纖毛蟲均屬于尾絲蟲Uronemasp.，但兩者的18S rDNA序列存在一個堿基的差異；從大菱鲆體表分離出的盾纖毛蟲屬于偽康纖蟲Pseudocohnilembussp.，尚屬國內首次報道。

2)3種盾纖毛蟲在L-15培養基中培養的種群密度較MEM、RPMI1640高，L-15培養基為3種盾纖毛蟲的最佳體外培養基。推薦體外培養條件為溫度20 ℃、鹽度30、pH 7.2。本研究結果可為海水養殖動物盾纖毛蟲的分離鑒定及進一步研究提供科學參考。

3)通過調查發現，病料采集養殖場所用水源靠近人類生活區，養殖水源未經充分沉淀過濾消毒等處理直接使用，養殖污水未經處理直接流入附近海水，以及養殖水池消毒不徹底等，造成水體中有大量盾纖毛蟲滋生、繁殖，并有機會寄生在養殖海水魚類及刺參體上，引發盾纖毛蟲病。因此，在養殖過程中，保持良好的養殖環境，徹底消滅水體病原對預防疾病發生具有重要的意義。