基于網絡藥理學的康艾注射液抗非小細胞肺癌作用機制分析

林 玲，吳勤研，宋熙薇

中國人民解放軍東部戰區總醫院 藥劑科，南京 210002

肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤，發病率、致死率居于首位，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%，大部分的NSCLC 患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳手術時期，因而化療成為其治療的主要手段之一[1-3]。近年來，相關文獻報道[4，5]化療藥物與中藥制劑聯合使用，具有不良反應低、治療效果好的特點，如康艾注射液?？蛋⑸湟河牲S芪、人參和苦參素制成，具有益氣扶正、增強機體免疫、減輕化療毒副反應、提高化療效果的作用[5]，用于治療原發性肝癌、肺癌、直腸癌和惡性淋巴癌等。以往研究者對康艾注射液的研究集中在單味藥物的藥效成分、藥理作用及化療藥物聯合使用的臨床研究上。然而康艾注射液中涉及成分較多，可能通過多靶點、多途徑發揮藥理作用，其相關作用機制研究仍不明確。網絡藥理學是以系統生物學為基礎，從整體角度探索“藥物-靶點-疾病”復雜網絡關系，廣泛運用于中藥復雜的作用機制研究[6，7]。本研究借助網絡藥理學的技術與方法，對康艾注射液多成分、多靶點間復雜網絡關系進行較全面系統地分析，為進一步深入研究其藥理作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 數據庫

中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；通用蛋白質數據庫UniProt（http://www.uniprot.org/uploadlists/）；人類基因數據庫Genecards（http://www.genecards.org/）；蛋白質互作平臺STRING10.5（http://www.string-db.org/）；生物學信息注釋數據庫DAVID6.8（http://david-d.ncifcrf.gov/tools.jsp）。

1.2 康艾注射液中主要化學成分的收集與篩選

在TCMSP 數據庫的“search”一欄中，分別輸入黃芪、人參和苦參，收集相關的化學成分；設置閾值標準[7]（口服利用度OB＞30%、類藥性DL＞0.18），對上述化學成分進行篩選。

1.3 藥物作用靶點的篩選

在TCMSP 數據庫的“target”一欄中，分別輸入化合物編號（如：MOL000392），得到該化合物的對映靶點；將靶點導入通用蛋白質數據庫UniProt，選擇“Human genes”，得到人的靶點基因；在人類基因數據庫Genecards 輸入“NSCLC”，得到非小細胞肺癌全部基因，與上述靶點基因進行映射，得到康艾注射液作用于非小細胞肺癌的靶點基因。

1.4 康艾注射液的化合物-靶點網絡的構建

將化合物與其對映的靶點基因在Excel 表中列出，化合物名稱設置為“#node1”，靶點基因欄設置為“node2”。將Excel 表導入Cytoscape 3.7.0 軟件，得到化合物-靶點網絡結構關系圖；用Cytoscape 3.7.0軟件中“Network analyzer”功能，對網絡拓撲屬性進行分析，得到康艾注射液抗非小細胞肺癌的主要活性成分。

1.5 康艾注射液蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網絡構建

將上述1.3 得到的靶點基因上傳到STRING 10.5 軟件（http://www.string-db.org/），設置物種為“Homo sapiens”，進行檢索，得到PPI 網絡結構圖；用STRING 10.5 軟件對PPI 網絡圖進行分析，得到相關靶點參數。

1.6 康艾注射液相關靶點基因本體GO 富集分析和京都基因百科全書（KEGG）生物通路富集分析

將PPI 網絡中的蛋白質靶點導入生物學信息注釋數據庫DAVID6.8（http://david-d.ncifcrf.gov/tools.jsp），對PPI 網絡中涉及蛋白靶點進行GO 功能和KEGG 通路生物富集分析。

2 結果

2.1 康艾注射液中活性化合物的篩選

在TCMSP 數據庫里，檢索黃芪，共得到87 個化合物，篩選出8 個符合條件化合物；檢索人參，共得到190 個化合物，篩選出8 個符合條件化合物；檢索苦參，共得到113 個化合物，篩選出5 個化合物。上述篩選閾值[7]分別是OB＞30%、DL＞0.18。OB值代表口服利用度，藥物經過口服途徑給藥后吸收進入血液循環的相對量；DL 代表類藥性，化合物與已知藥物的相似性，用于發掘高質量的先導化合物。結合相關文獻[8]引入槐醇（sophranol）和槐胺（sophoramine）兩個化合物?？蛋⑸湟褐泻械?3個活性化合物基本信息。見表1。

2.2 康艾注射液化合物-靶點相互作用網絡

利用23 個化合物與其對映的靶點的關系，構建化合物-靶點網絡，見圖1。在化合物-靶點網絡中，總共包括123 個節點（23 個化合物節點和100個靶點節點）和383 條邊。對網絡拓撲屬性進行分析，得出相應的節點度值（degree）和介數參數（betweenness centrality）。度值表示網絡中與節點連接的路線條數，度值越大，表示該節點在整個網絡中起到重要樞紐作用，可能是主要活性成分或靶點；介數則表示該節點在網絡中所有最短路徑中經過該節點的路徑條數與最近路徑總數比。度值和介數是量化某個節點在拓撲網絡中的重要性[6，7，9，10]。

表1 康艾注射液中含有23 個活性化合物基本信息

圖1 康艾注射液化合物-靶點網絡

表2 列出了化合物-靶點網絡中化合物和靶點的度值和介數（篩選設置Degree＞4[6]）。

從表2 中看出，在康艾注射液多成分中，起主要作用的化合物有MOL000422（山奈酚），MOL000354（異鼠李素），MOL000358（β-谷甾醇），MOL000449（豆甾醇），MOL006634（氧化苦參堿）和MOL005944（苦參堿）等；作用靶點有PTGS2、PTGS1、SCN5A、PRKACA 和HSP90A 等。

表2 康艾注射液化合物-靶點網絡關鍵節點及其拓撲學性質

2.3 康艾注射液靶點PPI 網絡的構建與分析

蛋白互作網絡（protein-protein interaction，PPI）是反映蛋白之間相互作用關系的網絡，能分析出一系列生物分子相互作用有關的重要靶蛋白。為了更好地理解康艾注射液對非小細胞肺癌的作用機制，基于PPI 關系，采用STRING 10.5 軟件構建康艾注射液靶點的PPI 網絡。分析PPI 網絡，得到93 個蛋白質節點（其中有7 個節點未顯示），597 條相互作用的邊（PPI enrichment p-value：＜1.0×10-16）。

為了提供更精確的結果，用STRING 10.5 軟件分析該網絡（見上述材料方法1.5），得到主要相關靶點（涉及蛋白IL6、TNF、JUN、MYC、CASP3、MAPK8、PTGS2 等），用Origin8.0 軟件作圖，見圖2。

將上述蛋白靶點導入STRING 10.5 軟件，得到篩選后的蛋白互作網絡，見圖3。

圖2 PPI 網絡中的重要靶點（篩選后）

圖3 康艾注射液相關靶點的PPI 網絡（篩選后）

2.4 康艾注射液GO 富集與KEGG 通路富集分析

采用DAVID6.8 平臺上的GO 和PATHWAY 富集分析功能，對康艾注射液PPI 網絡中涉及93 個蛋白質功能進行分析。對GO 進行富集分析，得到43個條目[設置錯誤發生率（FDR＜0.01）作為篩選條件，見表3]，其中生物過程相關的條目有32 個，涉及氧化反應、細胞對化學刺激反應、對有毒物質反應、內源刺激反應、細胞信號傳導、激素應答和細胞增殖的調控等方面；分子功能相關的條目6 個，涉及蛋白結合、酶結合位點、乙酰膽堿受體誘導活性和G蛋白偶聯胺受體活性等方面；細胞組成相關的條目5 個，涉及膜筏、質膜區域和投射神經元等方面。

對KEGG 通路富集分析中，得到50 個信號通路，根據FDR 篩選出5 條通路（見表4），分別為癌癥通路、白介素-17 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、雌激素受體信號傳導通路和NF-kappa B 信號通路，推測康艾注射液的有效成分可以作用于這些通路來達到抗NSCLC 的作用。在本研究中，癌癥通路上有27 個基因富集，分別為BAX、BCL2、CASP3、ESR1、ESR2、GSK3B、GSTM1、GSTM2、GSTP1、HMOX1、HSP90AA1、IFNG、IL6、JUN、MAPK8、MMP1、MMP2、MYC、NCOA1、NFKBIA、NOS2、PIM1、PPARG、PRKACA、PTGS2、RELA、RXRA；有14 個基因富集在白介素-17 通路上，分別為CASP3、GSK3B、HSP90AA1、IFNG、IL1B、IL6、JUN、MAPK14、MAPK8、MMP1、NFKBIA、PTGS2、RELA、TNF；有13 個基因富集在腫瘤壞死因子通路上，分別為CASP3、ICAM1、IL1B、IL6、JUN、MAP2K4、MAPK14、MAPK8、NFKBIA、PTGS2、RELA、TNF、VCAM1；有11 個基因富集在雌激素受體通路上，分別為BCL2、ESR1、ESR2、HSP90AA1、JUN、MMP2、NCOA1、NCOA2、OPRM1、PGR、PRKACA；有9 個基因富集在NF-kappa B 信號通路上，分別是BCL2、ICAM1、IL1B、NFK BIA、PLAU、PTGS2、RELA、TNF、VCAM1。

表3 康艾注射液PPI 網絡中的GO 條目（FDR＜0.01）

表4 康艾注射液PPI 網絡中的通路（FDR＜0.01）

3 討論

網絡藥理學是基于系統生物學的理論，對復雜生物系統的網絡分析，擇取特定信號節點（Nodes）進行多靶點藥物分子設計的新興學科；根據其具有整體性和系統性的特點，用于挖掘復方中藥制劑的藥效成分、作用靶點及預測適應癥[6]?？蛋⑸湟菏墙浻扇藚?、黃芪和苦參素3 味中藥制備而成的一種抗癌藥，臨床上與化療藥物（如順鉑）聯合治療非小細胞肺癌效果顯著[11]。本研究依托TCMSP 中藥系統藥理學分析平臺研究了康艾注射液中3 味中藥的有效成分，同時構建了化合物-靶點網絡和蛋白互作PPI 網絡，利用DAVID6.8 平臺對PPI 網絡中涉及的蛋白質進行GO 富集和KEGG 信號通路富集。

化合物-靶點網絡中涉及的關鍵的化合物有山奈酚、β-谷甾醇、氧化苦參堿和苦參堿等。山奈酚是廣泛存在于中藥材、水果和蔬菜中的黃酮類化合物，具有抗癌、抗炎、抗動脈粥樣硬化，保護神經系統和防治糖尿病等藥理作用[12]。山奈酚具有良好的抗癌生物活性，對白血病、肺癌[13]、結腸癌[14]和肝癌[15]等多種癌癥有顯著療效。β-谷甾醇是植物甾醇的一類，存在于蔬菜、茶葉、中藥材和水果中，具有抑制腫瘤生長、防治前列腺增生、抑制乳腺增生和免疫調控等生物活性[16]。周玲玉等[17]研究β-谷甾醇對人肺癌A549 細胞增殖及凋亡的影響，發現β-谷甾醇通過抑制肺癌A549 細胞周期中的G2/M 期，促使癌細胞凋亡，達到抗腫瘤的目的。氧化苦參堿通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導癌細胞分化、抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤細胞黏度與浸潤轉移和抑制端粒細胞的活性等過程達到抗癌、防癌的作用[18]。上述篩選的化合物中，現有文獻報道較多的是氧化苦參堿[18]與康艾注射液臨床研究一致，而山奈酚、β-谷甾醇、異鼠李素和芒柄花素等研究較少，隨著研究不斷深入，越來越多的抗癌活性成分被逐漸挖掘出來。

化合物-靶點網絡中涉及重要靶點有PTGS2、PRKACA、HSP90A 等。PTGS2 又稱環氧化酶-2，是PEG2 合成的重要限速酶，在炎癥或腫瘤形成過程中表達上調[19]。熱休克蛋白（heat shock protein 90α，Hsp90α）廣泛存在于生物細胞中，具有維持細胞穩態的作用，隨著腫瘤惡性程度增高，Hsp90α 表達水平隨之升高[20]。張茂川等[21]研究發現，Hsp90α非小細胞肺癌患者血漿中的表達顯著高于健康體檢者，提出Hsp90α 可作為非小細胞肺癌輔助診斷的腫瘤標志物。蛋白互作PPI 網絡中涉及關鍵蛋白有IL-6、TNF、JUN、MYC[l12]和PTGS2 等。TNF 即腫瘤壞死因子，是機體重要的細胞因子，調控細胞凋亡、細胞免疫的功能。符一寧等[22]研究發現，吉西他濱聯合順鉑能改構人腫瘤壞死因子，治療非小細胞肺癌，還可以降低患者抑制因子、胸苷激酶-1 表達水平。白介素-6（IL-6）是由T 細胞與成纖維細胞活化后產生的淋巴因子，參與炎癥反應。JUN 是原活化的蛋白激酶（MAPK）信號通路的成員之一，參與調節細胞凋亡等生理活動。有文獻報道[11]，在康艾注射液治療非小細胞肺癌（NSCLC）中，觀察指標有血管內皮生長因子（VEGF）、TNF-α 和IL-10 等。本研究挖掘出PTGS2、Hsp90α、IL-6、JUN 和MYC 等，經證實這些蛋白在腫瘤細胞形成、生長、凋亡中起到重要作用。本研究挖掘的化合物（如山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇等）具有抗癌生物活性，作用于上述蛋白靶點鮮有報道。

對GO 功能富集分析發現，康艾注射液治療非小細胞肺癌的基因功能主要體現在細胞增殖調控、細胞氧化反應、細胞信號傳導和內源刺激反應等方面。KEGG 通路涉及癌癥通路、白介素-17 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、雌激素受體信號傳導通路和NF-kappa B 信號通路，推測康艾注射液的有效成分可以作用于這些通路來達到抗NSCLC。NF-kappa B 又稱核轉錄因子-κB，具有多種生理功能的轉錄因子，該通路參與調控多種惡性腫瘤的形成[23]。NF-κB 能增加抗凋亡基因Bcl-2 的表達，減少變異細胞的凋亡，導致肺癌的發生[24]。此外，NF-κB可以上調CDK1、CDK2、cyclinA、cyclinB 和P-CDC2等，促使肺癌細胞G1/S、G2/M 期過渡，加快肺癌細胞的增殖[25]。路顏增等[11]研究康艾注射液輔助化療藥物治療晚期肺癌，發現該藥能顯著降低TNF-α 表達水平，有效緩解晚期肺癌患者的炎癥狀態，減輕毒副反應，提高機體免疫力?？蛋⑸湟簩Π捉樗?17信號通路和雌激素受體信號通路研究較少，是否通過上述通路來抑制NSCLC 需要深入研究。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學的技術與方法，篩選出的化合物藥理作用、作用靶點、信號通路與現有康艾注射液研究報道基本一致，相比而言，初步闡釋了康艾注射液發揮藥效的物質基礎，為進一步深入研究奠定基礎。此外，挖掘出康艾注射液能通過多個靶點、多條信號通路抗非小細胞肺癌，為進一步研究化療藥物輔助用藥提供參考依據。