甘蔗對梢腐病菌Fusarium不同病原種的室內離體抗性評價

王偉超，古幸靈，周主貴，劉麗敏，劉紅堅，李毅杰，段維興，雷敬超，黃思良，譚宏偉，劉平武，林善海,,

（1.廣西大學農學院，廣西 南寧 530004；2.廣西壯族自治區農業科學院農產品加工研究所，廣西 南寧 530007；3.廣西壯族自治區農業科學院甘蔗研究所/中國農業科學院甘蔗研究中心/農業農村部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530007；4.南陽師范學院生命科學與技術學院，河南 南陽 473061）

0 引言

甘蔗是我國重要的糖料作物［1］，隨著新臺糖系列甘蔗品種的引進和推廣種植，甘蔗梢腐病在我國發生呈加重趨勢，已經成為甘蔗生長過程中的主要病害［2］，嚴重影響甘蔗的產量與質量。甘蔗梢腐病是由鐮刀菌侵染引起的一種真菌性葉部病害［3］，國外現已報道的甘蔗梢腐病病原有7種，分別為F.sacchari、F.verticillioides、F.proliferarum、F.subglutinans、F.andiyazi、F.incarnatum和F.oxysporum［4-7］，但不同國家和蔗區的病原種群及優勢種存在差異。馬來西亞已報道的種有3個，分別為F.sacchari、F.proliferatum和F.subglutinans，以F.sacchari為主［8-9］。伊朗目前報道有3種，分別為F.verticillioides、F.proliferatum和F.subglutinans，優勢種為F.verticillioides［10-11］。南非報道的3個種為F.sacchari、F.proliferatum和F.andiyazi，優勢種為F.sacchari［12］。我國已報道甘蔗梢腐病病原有5個種，分別為F.sacchari、F.verticillioides、F.proliferatum、F.andiyazi和F.oxysporum［6,13-15］,Lin等［16］和Meng等［13］的研究結果表明甘蔗鐮刀菌（F.sacchari）為國內甘蔗梢腐病菌的優勢種。目前國內對甘蔗鐮刀菌的研究和報道較少，梢腐病的防治還沒有科學有效的解決辦法，通過梢腐病不同病原菌致病力進行測定，對篩選高抗種質資源和選育病害高抗優良新品種具有重要的科學意義。

我國對梢腐病的抗性研究不多，主要集中在田間的抗性評價［2，3，17，18］。上個世紀90年代，劉夢林等［3］最早開始對甘蔗梢腐病的抗性展開了一些研究，并初步制定了一些抗性評價標準。林善海研究團隊在此基礎上建立了甘蔗梢腐病田間抗性評價體系，明確了不同甘蔗種植區域、不同品種（系）以及不同種植時期存在感抗梢腐病差異性［2］。并對廣西蔗區主要栽種的13個推廣品種進行了田間抗性評價，其中2個中抗梢腐病品種、9個抗梢腐病品種、2個高抗梢腐病品種［18］。李文鳳等［19］根據發病株率劃分5個等級，并對甘蔗新良種及主栽品種進行自然抗性評價。Wang等［20］對88個甘蔗材料采用注射接種法進行梢腐病抗性鑒定，結果發現GT37和GT21為感梢腐病材料，ROC22和YT94-128為抗梢腐病材料。植物病害的發生除了自身的抗性，還與環境條件、病原種群和密度、栽培措施等因素密切相關，采用人工脅迫接種能最大限度反應植物本身的抗病性。本課題組前期以F. sacchari為接種體，采用室內離體接種方法結合病斑長度，初步建立了室內離體抗性評價方法［21］。本研究在前期基礎上擬采用離體葉片接種法，以多種甘蔗梢腐病病原菌為接種體，分析甘蔗對梢腐病菌的抗性，為進一步研究梢腐病菌與甘蔗相互作用奠定基礎，并為篩選抗病種質資源、甘蔗新品種選育和推廣提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗甘蔗材料選用ROC22、GT37、LC05-136等3個栽培品種及F134、CP34-120、CP72-1210、CP85-1308、CP89-170和HoCP02-263等6份甘蔗種質材料，其中3個栽培品種ROC22、GT37和LC05-136在廣西蔗區生產上對梢腐病的抗性分別表現為抗病、高感和高感（相對GT37稍輕一些）。蔗種剝葉砍種后于2019年4月10日種植在廣西農業科學院甘蔗研究所大棚內。利用野生菌株甘蔗鐮刀菌（F. sacchari）PB4-21和PB6-3菌株、新知鐮刀菌（F. andiyazi）PB3-1菌株、層出鐮刀菌（F. proliferatum）NN2菌株以及PB6-3 和PB3-1 的EMS 誘 變 菌 株（MPB6-3 和MPB3-1）共計6份材料作為接種體。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種體準備

將保存于-80℃的梢腐病菌野生菌株PB3-1、PB6-3、PB4-21、NN2及2個EMS誘變菌株MPB6-3和MPB3-1菌液中吸取20μL菌液于20mL馬鈴薯葡萄糖水培養基（PDW）中，30℃、220rpm搖菌2d左右，待菌絲長出后進行二次活化，從活化的菌液中吸取20μL滴加到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）表面，采用涂布法，將菌液均勻地涂布在培養皿表面，封口膜封口，于28℃恒溫培養箱中倒置培養3d，接種前用打孔器將平板打成9mm的菌餅用于室內離體接種。

1.2.2 室內離體接種

參照孫潔瑩等人［22］的離體葉片接種方法，分別于7月8日（分蘗期）和9月23日（伸長期）用菌株進行接種，剪取10份不同甘蔗材料+2～+3葉健康葉片于室內進行針刺接種，每個材料3個重復，每個重復3張葉片。先用75%酒精將甘蔗葉片擦凈，將每張葉片剪成13cm左右片段，葉片兩端用酒精進行消毒防止傷口感染，在葉脈中間一側進行針刺處理，將長有菌絲一面的菌餅覆蓋在傷口處，每片葉接種1塊菌餅，處理好的甘蔗葉片放置于培養皿中，培養皿中放一張濕潤濾紙對葉片進行保濕，室溫下培養（濕度80%～90%），跟蹤觀察病斑發展情況。

1.2.3 病情調查和抗性評價

根據前期的研究結果［21］，選擇在接種后第7d測量病斑的長度，沿著葉脈方向測量黃色暈圈的長度，根據病斑長度劃分梢腐病發病等級和抗性等級，結果見表1。

1.3 數據統計與分析

根據病斑長度，利用Excel 2007對接種發病的數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同菌株致病力測定

測試的3個Fusarium種5個菌株均可引起測試的9份甘蔗材料發病。菌株PB3-1能夠較快識別并侵入甘蔗葉引起發病，除了在ROC22和CP72-1210品種上較NN2菌株快外，后期病斑的拓展上相對較其他菌株弱。5個菌株對甘蔗CP85-1308品種致病力較弱，對F134和CP72-1210兩個甘蔗品種致病力較強，接種第7d所有的材料病斑直徑均超過100mm，結果見表2。

表1 甘蔗梢腐病室內接種發病等級劃分標準

2.2 誘變菌株和野生菌株致病力測定

采用F. andiyazi和F. sacchari的兩個野生菌株（PB3-1和PB6-3）與誘變菌株（MPB3-1和MPB6-3）對9份甘蔗材料進行致病力比較。結果發現，誘變菌株致病力整體上明顯變弱，但在個別甘蔗材料上結果相反，F. andiyazi誘變菌株MPB3-1對甘蔗材料ROC22、HoCP02-263和CP72-1210及F. sacchari誘變菌株MPB6-3對甘蔗材料F134、CP34-120、CP72-1210、LC05-136和CP89-170的致病力均較野生菌株強，結果見表3。說明誘變后，菌株的部分致病力基因發生變異，但菌株的致病力是由多個基因共同作用，且不同甘蔗品種對病原的不同致病基因響應效果不同。

表2 不同甘蔗梢腐病菌對甘蔗種質材料離體接種結果

2.3 不同甘蔗材料對不同菌株抗性評價

供試的9個甘蔗種質材料中，甘蔗品種ROC22對3個Fusarium種4個菌株均表現為感病或高感，感病程度高于生產中的表現，可能由于人工接種與田間的感病機制存在較大差異。GT37對3個Fusarium種均表現為高感，與生產上的表現一致。LC05-136僅對F. sacchari PB6-3菌株表現為高感，但對相同種另外一個菌株PB4-21反而表現為中抗，說明菌株致病力存在較大差異；另外，LC05-136對PB3-1和NN2表現為感病，感病情況與生產上的表現一致。CP85-1308對5個不同菌株抗病性最好，整體抗病性較好，F134和CP72-1210這2個甘蔗品種表現均為高感，整體抗病性較弱，結果見表4。

2.4 不同甘蔗材料對誘變菌株與野生菌株抗性評價

CP34-120和LC05-136分別對PB3-1和誘變菌株MPB3-1的抗性水平表現相同，ROC22、CP72-1210和HoCP02-263對野生菌株PB3-1抗性水平較誘變菌株MPB3-1強，其余4個品種則相反。ROC22和CP72-1210分別對PB6-3和誘變菌株MPB6-3的抗性水 平 也 表 現 相 同，LC05-136、F134、CP34-120 和CP89-170對野生菌株PB6-3的抗性水平較誘變菌株MPB6-3強，其余3個品種則相反，結果見表5。

表3 誘變菌株和野生菌株對人工接種致病力測定

表4 不同甘蔗材料對不同菌株抗性評價

2.5 不同接種時期致病力比較

綜合兩個甘蔗生長期葉片發病的測定結果，除PB3-1接種CP85-1308伸長期較分蘗期發病情況較重，PB3-1 接 種F134，PB6-3 接 種ROC22、CP85-1308，MPB6-3接種ROC22、CP34-120和CP85-1308發病情況相同外，整體上甘蔗品種伸長期整體接種情況較分蘗期發病較輕，甘蔗病原菌在分蘗期致病力較強，伸長期致病力較弱，結果見表6。

3 討論

甘蔗品種的抗病性受到區域性氣候、生態環境、栽培方式和病原種群等因素的影響，而同一品種對梢腐病不同病原的抗性也不同［20］。本研究結果表明，不同病原菌對甘蔗的致病力存在明顯差異。部分菌株實驗結果與本實驗前期結果不同，可能是由于甘蔗不同生育期導致的差異。整體結果與前人的田間抗性調查結果略有差異，前人［17-18］研究表明，ROC22田間表現為抗病，但在本實驗中整體表現為中感或高感，說明其他因素對ROC22的抗病性起到了主導作用。LC05-136田間表現高感，但在本研究中對F. sacchari強致病力PB6-3菌株表現為高感，對弱致病力F. sacchari PB4-21菌株表現為中抗，而對F. proliferatum和F. andiyazi表現為感病，說明田間引起LC05-136梢腐病嚴重發生時的病原很可能是F. sacchari。GT37在生產中也是高感梢腐病的品種，在本研究結果中，均對3個鐮刀菌種表現為高感，說明田間引起GT37梢腐病嚴重發生的病原很可能是這3個鐮刀菌種中其中一個，或者多個符合侵染。PB6-3對LC05-136表現為強致病力菌株，PB4-21表現致病力較弱，但在GT37上的致病力恰好相反，說明不同基因型甘蔗品種對同一個病原菌治病基因的響應不同。CP72-1210在田間表現為中抗［23］，但在本實驗中表現均為高感，可能由于不同菌株致病力不同導致，說明不同病原菌對甘蔗的致病力存在明顯差異。甘蔗和病原菌在長期的互作進化中會發生變異而喪失抗病性，因此試驗篩選出的高抗、中抗材料還應進行長期和大面積的田間種植與調查，才能更系統全面的評價甘蔗品種的抗病性。

表5 不同甘蔗材料對EMS誘變菌株與野生菌株抗性評價

表6 不同生育期甘蔗材料對梢腐病菌的抗性比較

甲基磺酸乙酯（EMS）誘變是最為有效的化學誘變技術方法之一，其能誘發產生高密度的系列等位基因點突變，具有誘變頻率高［24］、對材料損傷輕和成本低［25］等特點，被廣泛用于植物和微生物誘變育種中。Statler［26］和Teo等人［27］用EMS處理小麥稈銹菌、小麥葉銹菌和燕麥稈銹菌后，獲得了毒性不同、顏色變異和冬孢子發育速率不一的不同表型突變體。姚秋燕等人［28］在此基礎上研究了EMS誘導小麥條銹菌毒性突變，獲得了5個突變菌系，研究證實了小麥條銹病菌毒性突變是其毒性變異的重要途徑。本實驗采用F. andiyazi和F. sacchari的兩個野生菌株與誘變菌株對9份甘蔗材料進行致病力比較。結果發現，誘變菌株致病力整體上明顯變弱，但在個別甘蔗材料上結果相反。說明誘變后，菌株的部分致病力基因發生變異，但菌株的致病力是由多個基因共同作用，而且不同甘蔗品種對病原的不同致病基因響應效果不同。

綜合兩個時期發病的調查結果，9個甘蔗品種伸長期整體發病較分蘗期輕。通過不同生育期接種試驗對比可以看出，不同甘蔗材料對梢腐病的抗性不同，甘蔗的不同生長時期抗病性也會發生變化。這可能與葉片的老嫩程度有關，分蘗期的葉片相對伸長期的葉片嫩，葉片纖維化和木質化程度也相對較低，易于病原菌的入侵，另外還可能與礦質營養元素的吸收及細胞結構有關，其抗性差異機制有待深入研究。