基于酵母表面展示技術的耐熱木聚糖酶全細胞催化劑的構建及酶學性質研究

鄧香連，劉清怡，熊海容，張 莉

（中南民族大學生命科學學院，武漢430074）

木聚糖酶（Xylanase）是可將木聚糖降解為低聚木糖和少量木糖的一類酶，主要包括內切木聚糖酶、外切木聚糖酶和木糖苷酶，其中內切木聚糖酶能水解木聚糖主鏈中的β-1，4糖苷鍵生成木二糖、木三糖等寡糖，是降解木聚糖最主要的酶［1，2］。木聚糖酶來源廣泛，可從動物、植物或微生物中獲得，目前研究較多的是來源于細菌或真菌的木聚糖酶［3］。已有多種不同來源的木聚糖酶在多個宿主中成功進行了異源表達，如大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、畢赤酵母等，不同程度地提高了木聚糖酶的表達量［4，5］。

木聚糖酶是一種重要的工業酶制劑，在飼料、造紙、食品、紡織等領域具有廣闊的應用前景［6］。但在具體應用過程中環境條件要求較苛刻，如飼料生產制粒工藝中的調質、制粒等過程需要70℃以上的高溫處理，使添加的酶活性損失很大，降低了使用效率［7］；麻類紡織中苧麻脫膠、造紙中紙漿溶解和漂白等工藝需要強酸、強堿等處理，也會使酶的活性大大降低［8］，因此提高酶在高溫、酸性、堿性、含有機溶劑等條件下的穩定性受到越來越多的關注。

微生物表面展示技術近年來發展迅速且應用廣泛，利用微生物細胞展示酶作為催化劑（也稱全細胞催化劑）不僅具有固定化酶的特性，且可省去繁瑣的分離純化操作，制備方法簡單，易于回收和再生利用［9］。多項研究顯示全細胞催化劑較游離酶表現出更好的穩定性，Yuzbasheva等［10］在解脂耶氏酵母中獲得脂肪酶Lip2p的全細胞催化劑，在50℃處理5 h后殘留約83%的酶活力，而游離酶在50℃處理1 h酶活力幾乎降為零，此外將全細胞催化劑和游離酶用EDTA、SDS、DMSO等試劑處理24 h，全細胞催化劑殘余的酶活力均高于游離酶；Wang等［11］在釀酒酵母中展示表達葡萄糖氧化酶GOx，發現GOx全細胞催化劑較游離酶在30～60℃具有更好的熱穩定性。

本研究利用酵母表面展示技術將實驗室前期篩選獲得的耐熱木聚糖酶DSB［12］展示表達在畢赤酵母細胞表面獲得DSB全細胞催化劑，并對全細胞催化劑和游離酶的酶學性質進行比較分析，為DSB全細胞催化劑的工業應用提供一定的理論依據，也為獲得穩定性更好的酶制劑提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒含木聚糖酶DSB基因的重組質粒pPICZαA/DSB由實驗室構建并保藏?？寺∷拗鞔竽c桿菌Top10、表達宿主巴斯德畢赤酵母X33均由實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑PrimeSTAR Max DNA聚合酶、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker等購于大連寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、PCR清潔試劑盒、質粒小量提取試劑盒等購于上海Axy?Prep公司；底物木聚糖為實驗室自提樺木木聚糖［13］；Tryptone和Yeast Extract購于Oxoid公司；山梨醇、瓊脂、無氨基酵母氮源YNB、生物素均購于Biosharp公司；DSB游離酶由實驗室制備；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基大腸桿菌培養基LB、大腸桿菌抗性篩選平板低鹽LB（含抗生素Zeocin，終濃度25μg/mL）、畢赤酵母培養基YPD、畢赤酵母抗性篩選平板YPDSZ（含抗生素Zeocin，終濃度100μg/mL）、畢赤酵母生長/誘導培養基BMGY/BMMY等配方見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。

1.2 方法

1.2.1 展示表達DSB重組質粒的構建以畢赤酵母細胞壁蛋白Gcw61（Accession in NCBI XP_002 494332）［14］為錨定蛋白，去除自身信號肽后設計引物（表1），并在5'端和3'端分別引入KpnⅠ和NotⅠ位點（下劃線標記）。以畢赤酵母X33基因組為模板進行PCR擴增，對獲得的GCW61基因片段與質粒pPICZαA/DSB同時進行雙酶切，然后進行連接、轉化和篩選后獲得展示表達DSB重組質粒pPICZαA/DSB-GCW61，并送至武漢擎科生物技術有限公司進行測序驗證。

表1 PCR擴增引物序列

1.2.2 展示表達DSB重組菌的構建及誘導表達對pPICZαA/DSB-GCW61使用SacI進行線性化，然后采用電轉化法轉化宿主菌畢赤酵母X33感受態細胞，涂布于YPDSZ抗性篩選平板上，于28℃培養2～3 d，使用AOX1通用引物對轉化子進行菌落PCR鑒定獲得展示表達DSB重組菌X33/DSB-GCW61。將該重組菌接種于BMGY培養基中，28℃、250 r/min過夜培養至OD600達2～6，取適量菌體重懸于BMMY培養基中，控制起始OD600約為1，28℃、250 r/min連續發酵168 h，每隔24 h取樣，并補加1%的甲醇。以畢赤酵母X33作為陰性對照，所有試驗均重復3次。

1.2.3 重組菌的免疫熒光顯微鏡分析發酵結束后取1 mL菌懸液，離心去除上清，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4）洗滌菌體3次，重懸至含10 mg/mL BSA的PBS中，調整樣品OD600值約為5。取200μL樣品加入鼠源抗6×His標簽單抗（1∶200稀釋），室溫下低速振蕩孵育2 h。孵育結束后用PBS洗3次，重懸至含10 mg/mL BSA的PBS中，加入Alexa Flour 488標記羊抗鼠IgG抗體（1∶200稀釋）于避光處室溫低速振蕩孵育1 h。孵育結束后用PBS洗3次，使用激光共聚焦顯微鏡觀察，激發波長為488 nm，以畢赤酵母X33細胞作為陰性對照。

1.2.4 重組菌展示表達DSB酶活力的測定對X33/DSB-GCW61進行誘導表達，每隔24 h取樣后離心去除上清，用50 mmol/L pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液洗滌菌體3次，然后用等量緩沖溶液重懸后獲得DSB全細胞催化劑樣品。以0.5%木聚糖為底物，采用DNS法［15］測定酶活力，同時測定菌懸液的OD600值，根據1OD600=0.245 g/L［9］計算出最終酶活力。酶活力單位定義為在最適溫度和pH條件下，1 min內水解0.5%木聚糖底物產生1μmol木糖所需要的全細胞催化劑的量。以畢赤酵母X33細胞作為對照，所有試驗均重復3次。

1.2.5 DSB全細胞催化劑和游離酶的酶學性質比較分析

1）溫度對全細胞催化劑和游離酶酶活力的影響。在pH 6.5條件下，分別在40、50、60、65、70、75、80℃測定全細胞催化劑和游離酶的酶活力，設2種酶的最高酶活力為100%，計算不同溫度條件下2種酶的相對酶活力。取用pH 6.5檸檬酸緩沖液適當稀釋后的2種酶置于70℃水浴處理2.5 h，每隔30 min測定2種酶的酶活力，設未處理的2種酶的酶活力為100%，計算在70℃條件下處理不同時間2種酶的殘余酶活力。

2）pH對全細胞催化劑和游離酶酶活力的影響。分別配制pH 4.0～8.0 50 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液體系，以上述緩沖液分別配制0.5%的木聚糖底物，且以對應pH緩沖液稀釋2種酶，分別使用上述底物測定2種酶的酶活力，反應溫度均為65℃，設2種酶的最高酶活力為100%，計算不同pH條件下2種酶的相對酶活力。分別用pH 3.0和pH 6.0的緩沖液適當稀釋2種酶后，放置40℃水浴處理2.5 h，每隔30 min分別測定2種酶的酶活力，設未處理的2種酶的酶活力為100%，計算不同pH條件下處理不同時間2種酶的殘余酶活力。

3）高濃度鹽對全細胞催化劑和游離酶酶活力的影響。在2種酶的酶活反應體系中分別加入1%、3%、5%、10%、15%的NaCl或KCl，然后在65℃、pH 6.5條件下測定2種酶的酶活力，以不加鹽的2種酶的酶活力為100%，計算不同鹽濃度條件下2種酶的相對酶活力。

4）有機溶劑對DSB全細胞催化劑和游離酶酶活力的影響。分別配制0～30 %的甲醇、乙醇、正丁醇、丙三醇溶液，用上述不同濃度的有機試劑稀釋2種酶并在室溫孵育30 min后，在65℃、pH 6.5條件下測定2種酶的酶活力，設未用有機試劑處理的2種酶的酶活力為100%，計算不同濃度有機試劑處理后2種酶的相對酶活力。

5）金屬離子和化學試劑對DSB全細胞催化劑和游離酶酶活力的影響。在2種酶的酶活反應體系中加入適量不同金屬離子和化學試劑溶液，使其終濃度為1.0 mmol/L，然后在65℃、pH 6.5條件下測定2種酶的酶活力，設未做處理的2種酶的酶活力為100%，計算不同金屬離子和化學試劑處理后2種酶的相對酶活力。以上所有試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 展示表達DSB重組菌的構建

以畢赤酵母X33基因組為模板，用引物P1/P2進行PCR擴增獲得錨定蛋白Gcw61的基因片段（144 bp），將其與質粒pPICZαA/DSB同時使用KpnⅠ和NotⅠ雙酶切，然后進行連接、轉化和篩選后獲得展示表達DSB的重組質粒pPICZαA/DSB-GCW61，經武漢擎科生物技術有限公司測序驗證載體構建成功（圖1）。隨后將該重組質粒轉入畢赤酵母X33，篩選獲得展示表達DSB的重組菌X33/DSB-GCW61。

圖1 重組質粒pPICZαA/DSB-GCW61

2.2 重組菌熒光的觀察

木聚糖酶DSB的N端帶有6×His標簽，取誘導表達168 h的重組菌使用抗體處理后在激光共聚焦顯微鏡下觀察（激發波長488 nm），結果如圖2所示。由圖2可見，重組菌細胞發出綠色熒光，表明錨定蛋白Gcw61成功將DSB展示表達在畢赤酵母細胞表面。

2.3 展示表達DSB重組菌的酶活分析

對重組菌X33/DSB-GCW61在搖瓶水平誘導表達168 h，每隔24 h取樣，檢測木聚糖酶全細胞催化劑的酶活力，結果如圖3所示。從圖3可以看出，隨著發酵時間的增加，DSB全細胞催化劑的酶活力會持續增長，且在72～144 h增長較快，144 h后酶活力趨于穩定，168 h時酶活力最大，達13 510 U/g。

2.4 DSB全細胞催化劑與游離酶酶學性質的比較分析

圖2 重組菌的熒光顯微鏡觀察

2.4.1 溫度對2種酶酶活力的影響測定不同溫度下DSB全細胞催化劑和DSB游離酶的酶活力，從圖4（A）可以看出，2種酶的最適反應溫度均為65℃，屬于高溫酶，且2種酶在50～75℃都能保持50%以上的相對酶活力，但DSB全細胞催化劑的相對酶活力均高于DSB游離酶。將2種酶在70℃條件下保溫處理，監測2種酶酶活力的變化，圖4（B）的結果顯示隨著處理時間的增加，2種酶的酶活力均逐漸降低，但DSB全細胞催化劑的相對酶活力始終顯著高于DSB游離酶，在處理120 min時，DSB全細胞催化劑的相對酶活力為50%，而DSB游離酶的相對酶活力已降至30%。工業應用中很多工藝需高溫處理，如飼料加工制粒過程溫度會高達70℃以上，DSB全細胞催化劑比DSB游離酶具有更好的耐熱性，這一特性使其在飼料行業具有較好的應用前景。

圖3 2株菌的酶活曲線

2.4.2 pH對2種酶酶活力的影響測定不用pH條件下DSB全細胞催化劑和DSB游離酶的酶活力，結果見圖5（A），2種酶的最適反應pH均為6.5，在pH 5.0～7.5均可保持60%以上的相對酶活力，但DSB全細胞催化劑的相對酶活力略高于DSB游離酶。將2種酶在pH 3.0和pH 6.0酸性條件下處理，監測2種酶酶活力的變化，從圖5（B）可以看出，在pH 6.0、40℃條件下處理150 min，DSB全細胞催化劑的酶活力無明顯下降，而DSB游離酶的酶活力下降約7%；而在pH 3.0、40℃條件下處理90 min，2種酶可以保持80%以上的相對酶活力，處理150 min也可保持60%以上的相對酶活力，DSB全細胞催化劑的相對酶活力均略高于DSB游離酶。表明DSB全細胞催化劑比DSB游離酶在酸性環境中更穩定，適用于工業應用中的酸性環境。

圖4 DSB全細胞催化劑和DSB游離酶的最適反應溫度（A）及熱穩定性（B）

圖5 DSB全細胞催化劑和游離酶的最適pH（A）及pH穩定性（B）

2.4.3 不同濃度NaCl和KCl對2種酶酶活力的影響在含不同濃度NaCl或KCl條件下分別測定2種酶的酶活力，從圖6（A）可以看出，當NaCl濃度在1%～5%時2種酶的酶活力均略有提高，當NaCl濃度高達10%和15%時，2種酶仍能維持80%以上的相對酶活力，但DSB全細胞催化劑的相對酶活力略高于DSB游離酶。而1%～15%的KCl對2種酶的酶活均有不同程度的促進作用，當KCl濃度為3%時DSB全細胞催化劑和DSB游離酶酶活力提高最多，分別達115%和113%。結果表明，DSB全細胞催化劑和DSB游離酶在高濃度鹽溶液中均能保持較高的酶活力，且DSB全細胞催化劑的耐鹽性更強，因此適用于工業中高鹽的環境。

2.4.4 有機溶劑對2種酶酶活力的影響4種常見有機溶劑對2種酶酶活力的影響見圖7。圖7（A）顯示5%～15%的甲醇對DSB全細胞催化劑的酶活力有顯著的促進作用，其中5%甲醇處理后DSB全細胞催化劑的相對酶活力增加幅度最大，達138%，且30%甲醇處理后DSB全細胞催化劑仍能維持94%的相對酶活力；而DSB游離酶的酶活力隨著甲醇體積分數的增加呈緩慢下降趨勢，30%甲醇處理后DSB游離酶殘余87%的相對酶活力。乙醇對2種酶酶活力的影響結果如圖7（B）所示，隨著乙醇體積分數的提高，2種酶的酶活力均緩慢降低，30%乙醇處理后2種酶均能維持75%以上的相對酶活力，但DSB全細胞催化劑的相對酶活力均略低于DSB游離酶。圖7（C）的結果顯示，5%丙三醇處理后DSB游離酶的相對酶活力增加至106%，隨后隨著丙三醇體積分數的提高其相對酶活力逐漸降低，30%丙三醇處理后殘留約60%的相對酶活力，而DSB全細胞催化劑隨著丙三醇體積分數的增加相對酶活力逐漸降低，且降低趨勢與游離酶基本一致。正丁醇對2種酶酶活力的影響見圖7（D），5%正丁醇處理后DSB全細胞催化劑和DSB游離酶的酶活力分別提高至122%和110%，隨后隨著正丁醇體積分數的提高2種酶的酶活力略微降低，30%正丁醇處理后2種酶均能保留90%以上的相對酶活力。

圖6 不同濃度NaCl和KCl對2種酶酶活力的影響

圖7 不同濃度有機溶劑對2種酶酶活力的影響

2.4.5 金屬離子和化學試劑對2種酶酶活力的影響不同金屬離子和化學試劑對2種酶酶活力的影響見表2。Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Ni2+對2種酶酶活力均有不同程度的促進作用，且除Mg2+、K+外，其他金屬離子存在時DSB全細胞催化劑酶活力的提高幅度均高于DSB游離酶；Zn2+對DSB游離酶酶活力有輕微的抑制作用，而對DSB全細胞催化劑酶活卻有顯著的促進作用，其相對酶活力提高至120.05%；Mn2+、Pb2+、Fe3+、SDS、EDTA對2種酶酶活力均有不同程度的抑制作用，且同種金屬離子或化學試劑導致2種酶酶活力的下降幅度無顯著差別；Cu2+對2種酶酶活力均有顯著的抑制作用，DSB全細胞催化劑和DSB游離酶的酶活力分別下降至38.84%和52.79%；Li+、Co2+對2種酶酶活力無明顯影響。表明DSB全細胞催化劑和DSB游離酶對大部分金屬離子和化學試劑有一定耐受性，且DSB全細胞催化劑的耐受性優于DSB游離酶。

表2 不同金屬離子和化學試劑對2種酶酶活力的影響（單位：%）

3 小結與討論

目前已有多種不同來源的木聚糖酶在大腸桿菌、畢赤酵母、枯草芽孢桿菌等多個宿主中成功進行異源表達［16-18］，但大部分均為分泌表達，需進行繁瑣的分離和純化后才能進行應用。利用微生物表面展示技術將酶展示表達在微生物細胞表面獲得全細胞催化劑，可省去繁瑣的分離純化步驟，制備方法簡單［19］。本研究利用畢赤酵母表面展示技術，以細胞壁蛋白Gcw61為錨定蛋白，將實驗室前期篩選獲得的耐熱木聚糖酶DSB進行展示表達，搖瓶發酵獲得的DSB全細胞催化劑的酶活力最高達13 510 U/g，高于木聚糖酶在其他宿主中展示表達的酶活力［4，20］。錨定蛋白的選擇對展示表達的酶活力有一定的影響，后續研究可選用更多的錨定蛋白進一步提高DSB全細胞催化劑的酶活力［21］。

木聚糖酶在飼料、造紙、食品、紡織等領域具有廣闊的應用前景，然而在具體應用過程中會有一些苛刻的環境條件，如高溫環境、強酸環境、高鹽環境、含有機溶劑的環境等，會對酶的活性造成很大的影響，從而降低了使用效率［22］。有研究表明在苛刻環境條件下全細胞催化劑較游離酶表現出更優的穩定性，Chen等［4］將來源于Cellulomonas fimi的木聚糖酶Cex展示表達在大腸桿菌細胞表面，Cex全細胞催化劑在40～65℃能維持70%以上的相對酶活力，而Cex游離酶在55℃時酶活力已降至43%，Cex全細胞催化劑在pH 6～8能維持約100%的相對酶活力，而Cex游離酶在pH 8時僅殘余29%相對酶活力；Yuzba?sheva等［10］在解脂耶氏酵母中構建獲得脂肪酶Lip2p的全細胞催化劑，將全細胞催化劑和游離酶分別用EDTA、SDS、DMSO、Tween 80、Triton X-100試劑處理24 h，全細胞催化劑殘余的酶活力均高于游離酶。本研究將制備的DSB全細胞催化劑與DSB游離酶的酶學性質進行了比較，分析發現在70℃高溫條件和pH 3.0的酸性條件下，DSB全細胞催化劑的穩定性均優于DSB游離酶；此外在高濃度NaCl、高濃度甲醇、多種金屬離子（Na+、Ca2+、Ni2+）的環境條件下，DSB全細胞催化劑均能維持較高的酶活力且穩定性優于DSB游離酶，為DSB全細胞催化劑的工業應用提供一定的理論依據，也為獲得穩定性更好的酶制劑提供一定的理論基礎。