氧化應激反應在二乙基亞硝胺誘導大鼠肝癌形成過程中的動態變化及意義

鐘長軍，王 秀，羅佳佳

(1. 安徽中醫藥高等?？茖W校，安徽 蕪湖 241003；2. 皖南醫學院中西醫結合研究中心,安徽 蕪湖 241002)

肝癌是最常見的一種消化系統惡性腫瘤，具有高度惡性、發病隱匿、進展快、治愈率低、病死率高的特點，是我國第4位常見惡性腫瘤及第3位腫瘤致死病因[1-2]。肝癌的發生原因目前尚未完全明確，但是與病毒性肝炎、飲食習慣等因素密切相關，近年來食物中的亞硝酸鹽類物質越來越受到關注[3-5]。亞硝酸鹽在體內特殊環境下能代謝成亞硝胺，是動物和人類的潛在致癌物,目前亞硝胺誘發的肝癌已經成為重大的公共衛生問題。亞硝胺的致癌性與活性氧自由基存在著密切關系[6]。因此本研究擬以二乙基亞硝胺誘導大鼠肝癌模型，觀察在誘癌過程中肝臟氧化應激狀態的動態變化，為臨床肝癌的預防與治療提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1動物 雄性SPF級SD大鼠36只，體重(165±15)g，購自南京市江寧區青龍山動物繁殖場，動物合格證號：SCXK(蘇)2017-0001。

1.2主要設備及試劑 HH-4數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)，DG5033A酶標儀，Cryotome E冰凍切片機(Thermo)，Nikon Eclipse C1正置熒光顯微鏡(日本尼康)。二乙基亞硝胺(上海一基實業有限公司)，大鼠谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、γ谷氨酰轉肽酶(γ-GT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、微量還原性谷胱甘肽(GSH-Px)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；HE染色試劑盒、大鼠8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)酶聯免疫檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)；ROS染液、DAPI、抗熒光淬滅封片劑(Servicebio公司)。

1.3模型制備 所有大鼠在同樣的環境進行飼養、造模，恒溫(21～25 ℃)、恒濕(45%～65%)，自由飲食，維持12 h明暗交替。依照隨機數字表法將大鼠隨機分為正常組12只和模型組24只。參照文獻[7]方法，模型組大鼠予以50 mg/kg 二乙基亞硝胺腹腔注射，前4周每周2次，以后每周1次，持續注射16周；正常組大鼠予以生理鹽水腹腔注射，方法同模型組。

1.4樣品采集與處理 2組分別于實驗第4，8，12，16周末依照隨機數字表法隨機取正常組大鼠3只、模型組大鼠6只，稱重并記錄，按照體重的標準注射10%水合氯醛(3 mL/kg注射)麻醉，大鼠采取仰臥位的姿勢，心臟采血，打開腹腔，摘取肝組織，稱重并記錄，然后切取1.0 cm×1.0 cm大小組織2塊，-80 ℃保存備用。所采集血液4 ℃靜置3 h后，3 000 r/min離心15 min，分離血清，-80 ℃保存備用。

1.5觀察指標與方法 ①記錄大鼠體重、肝臟重量，并計算肝臟系數。②將肝臟組織在4%甲醛溶液浸泡過夜進行固定，而后將其包埋在石蠟中，切成5 μm厚的切片，根據HE染色步驟進行染色，顯微鏡觀察拍照。③采用冰凍切片，免疫熒光檢測肝臟組織ROS表達情況。嚴格按照試劑盒說明操作，切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，陽性為產生綠色熒光。④采用可見分光光度法檢測2組大鼠血清中ALT、AST、γ-GT、MDA水平，采用ELISA法檢測血清8-OHdG水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2 結 果

2.12組大鼠體重及肝臟系數比較 實驗第4，8，12，16周末，模型組大鼠體重均顯著低于同期正常組(P均<0.05)，肝臟系數均顯著高于同期正常組(P均<0.05)；隨著時間的延長，模型組大鼠體重變化不明顯(P>0.05)，肝臟系數顯著增高(P<0.05)。見表1。

表1 2組大鼠體重及肝臟系數比較

2.22組大鼠肝臟病理學比較 正常組大鼠肝組織整體結構正常，肝細胞結構飽滿，中央靜脈輪廓清晰，肝索沿著中央靜脈呈放射狀排列，見圖1。實驗第4周末，模型組大鼠肝組織整體結構基本正常，肝細胞結構疏松，部分肝細胞可見明顯水腫，組織可見少量炎癥細胞浸潤，見圖2。實驗第8周末，模型組大鼠肝細胞可見廣泛水腫，部分肝細胞可見氣球樣變，組織可見大量炎癥細胞浸潤，見圖3。實驗第12周末，模型組大鼠肝組織整體結構異常，組織可見纖維結締組織明顯增生，明顯纖維化，組織可見大量炎癥細胞浸潤，見圖4。實驗第16周末，模型組大鼠部分肝細胞可見明顯壞死，組織可見較多腫瘤細胞浸潤，組織可見明顯炎癥細胞浸潤，見圖5。

圖1 正常組大鼠肝組織病理學HE染色表現(×200)

圖2 造模第4周末模型組大鼠肝組織病理學HE染色表現(×200)

圖3 造模第8周末模型組大鼠肝組織病理學HE染色表現(×200)

圖4 造模第12周末模型組大鼠肝組織病理學HE染色表現(×200)

圖5 造模第16周末模型組大鼠肝組織病理學HE染色表現(×200)

2.32組大鼠肝臟ROS表達情況比較 實驗第4，8，12，16周末，模型組大鼠肝臟ROS表達水平均顯著高于同期正常組(P均<0.05)，且隨著時間的延長顯著增高(P<0.05)。見表2及圖6。

圖6 2組大鼠肝組織ROS熒光染色情況(×200)

表2 2組大鼠肝組織中ROS表達熒光強度比較

2.42組大鼠血清ALT、AST和γ-GT水平比較 實驗第4，8，12，16周末，模型組大鼠血清ALT、AST、γ-GT水平均顯著高于同期正常組(P均<0.05)，且隨著時間的延長均顯著增高(P均<0.05)。見表3。

表3 2組大鼠血清ALT、AST、γ-GT水平比較

2.52組大鼠血清氧化應激指標水平比較 實驗第4，8，12，16周末，模型組大鼠血清GSH-Px、SOD水平均顯著低于同期正常組(P均<0.05)，血清MDA、8-OHdG水平均顯著高于同期正常組(P均<0.05)；隨著時間的延長，模型組大鼠血清GSH-Px、SOD變化不明顯(P均>0.05)，血清MDA、8-OHdG水平均顯著增高(P均<0.05)。見表4。

表4 2組大鼠血清GSH-Px、SOD、MDA、8-OHdG水平比較

時間MDA/(nmol/mL)正常組(3只)模型組(6只)tP8-OHdG/(ng/mL)正常組(3只)模型組(6只)tP第4周末6.72±0.7911.45±2.254.033<0.053.32±0.214.15±0.572.801<0.05第8周末6.47±1.7017.79±1.338.186<0.053.25±0.484.33±0.233.993<0.05第12周末7.29±0.5518.05±3.437.893<0.053.43±0.266.23±0.835.036<0.05第16周末8.61±0.8424.81±4.898.399<0.054.76±0.196.74±0.786.960<0.05F1.23816.2652.36725.364P>0.05<0.05>0.05<0.05

3 討 論

亞硝胺是四大食品污染物之一，大量流行病學資料顯示人類的食管癌、肝癌和胃癌等與之有關[8]。二乙基亞硝胺是一種具有肝毒性、細胞毒性及免疫毒性的化學物質，對肝臟具有較明顯的親和性，常被作為動物肝癌模型的誘導劑。本實驗結果表明，給予大鼠50 mg/kg二乙基亞硝胺腹腔注射，連續16周，從第4周起，ALT、AST開始升高，表明肝功能出現異常，肝臟出現明顯的損傷變化；第12周，γ-GT顯著升高，表明肝臟出現癌變。同時肝臟病理上亦隨著時間推移，與之相應，呈現炎癥→肝纖維化→肝硬化→癌變的變化過程。

氧化應激可能是形成肝癌的發病機制之一，ROS與細胞損傷、DNA突變、炎性反應之間有著密切的關系。在正常大鼠體內，氧化/抗氧化系統維持著動態平衡，從而保護體內細胞免于氧化損傷；而當ROS增長過多，或機體抗氧化酶活性下降，則導致氧化/抗氧化失衡，不能及時清除ROS，導致大量ROS蓄積；過多的ROS可攻擊肝細胞膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，形成脂質過氧化產物MDA，過量的MDA具有潛在的細胞毒性，又加劇了肝細胞膜的損傷[9-10]。同時ROS還能夠攻擊細胞內的DNA堿基，其攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子而產生的氧化性加合物8-OHdG為DNA氧化損傷的生物標志物，8-OHdG的表達與腫瘤的發生、發展、轉移、預后密切相關[11-12]。在DNA復制過程中, DNA鏈上8-OHdG與C以外的其他堿基配對，形成點突變, 8-OHdG的水平增高，提示DNA損傷增加和/或修復減少，是氧化應激致癌的主要機制之一[13]。通過多因素分析表明，8-OHdG代表的DNA氧化損傷是肝細胞癌發生的獨立危險因素,并且8-OHdG表達水平與肝細胞癌的發生概率呈正相關[14]。

目前已知，二乙基亞硝胺經肝細胞代謝后，會產生大量的ROS，ROS會損傷細胞，同時氧化應激還可激活癌癥發生的相關傳導通路，促進腫瘤的發生發展[15]。本實驗在動態觀察大鼠肝組織“肝損傷-肝纖維化-肝癌前病變-肝癌”的過程中，發現隨著時間的推移，模型組大鼠ROS表達水平呈漸進性增高；實驗第12周末，血清8-OHdG水平顯著升高，與此相應，肝臟出現肝硬化與癌前病變；在第16周肝臟癌變發生時，血清MDA水平較前顯著升高，8-OHdG保持在高水平狀態。提示ROS、MDA、8-OHdG可作為反映二乙基亞硝胺誘導肝癌發生發展過程肝細胞氧化應激損傷程度的標志物。而與之相反的是，大鼠體內的抗氧化物質SOD和GSH-Px水平在初始時出現下降，而后相對穩定，沒有繼續降低，提示在二乙基亞硝胺誘導肝癌的過程中，主要矛盾是ROS產生過多過快，不能被及時清除，而不是本身的抗氧化物質減少，但破壞了氧化/抗氧化平衡，產生氧化應激反應，繼而誘發了肝癌的發生。

綜上所述，在二乙基亞硝胺誘導大鼠肝癌的過程中存在嚴重的氧化應激，這種持續的氧化應激狀態可能是導致肝癌發生、發展的重要原因。提示在日常生活中可食用具有抗氧化作用的食品，增強體內的抗氧化物質，及時清除ROS，從而起到保護肝臟，預防肝癌發生的作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。