刺參“參優1 號”新品種在不同鹽度下的代謝特征和適應性研究*

王治平 李 彬 秦 蕾 王印庚,3 廖梅杰①榮小軍 張 正 范瑞用 鄭 炯

(1. 江蘇海洋大學 連云港 222005；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 青島 266071；3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室青島 266071；4. 青島瑞滋集團有限公司 青島 266408；5. 青島市漁業技術推廣站 青島 266000)

刺參(Apostichopus j aponicus)具有重要的營養和藥用價值，在20 世紀80 年代，其苗種規?；庇夹g得到突破。進入21 世紀，養殖產業迅猛發展，成為引領我國第5 次海水養殖浪潮的主要品種。然而，近年來隨著產業規模的急劇擴大，養殖業出現種質退化現象，表現出生長速度慢、病害頻發、存活率低等問題，導致每年數10 億的經濟損失(王印庚等, 2014)。中國水產科學研究院黃海水產研究所針對刺參病害問題，采用群體選育方法，培育出具有生長速度快、抗病力強、成活率高的刺參“參優 1 號”新品種(GS-01-016-2017)(全國水產技術推廣總站, 2018)，為刺參養殖良種化提供了種質基礎。刺參是狹鹽性海洋動物，鹽度作為重要的環境因子之一，對刺參的生長存活、呼吸排泄、能量和碳氮收支等生理生態影響顯著(龔海濱等, 2009; 袁秀堂等, 2006; Yuan et al, 2010;孟雷明等, 2013)。隨著刺參養殖產業的發展，尤其是“東參西養”和“北參南養”模式的快速發展，海參養殖區從最初的刺參自然分布區逐步拓展到黃河三角洲地區和閩、浙沿海。受海域自然鹽度及降水、結冰、化冰、蒸發等因素的影響，各養殖區池塘鹽度變化差異顯著。本研究對不同鹽度下刺參“參優1 號”的生長存活、呼吸代謝以及免疫酶活性進行了測定，旨在探明刺參“參優1 號”對鹽度的適應性，分析不同鹽度下，“參優1 號”苗種的免疫調節、耗氧率、排氨率、生長等代謝特征，進而確定其最適鹽度條件及其耐鹽機制，為該良種在不同地域推廣、健康養殖提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用刺參“參優1 號”苗種由山東青島瑞滋集團有限公司培育，苗種規格為(5.00±0.75) g。選取活力良好、健康無異的個體，在清潔海水中暫養7 d后用于后續實驗。

1.2 實驗方法

根據刺參對鹽度的耐受特點，本研究設定16 個鹽度梯度，分別為14、15、16、17、18、20、23、26、29、32、35、36、37、38、39 和40，實驗用水以砂濾潔凈海水為基礎，采用粗鹽或淡水調節至相應鹽度并分別儲備在體積為1 m3的單獨的PP 水槽中。鹽度實驗所用養殖水槽為容積30 L 白色塑料水槽，按照每天降低或升高1 個鹽度對海參進行梯度降鹽或升鹽。每個鹽度實驗設置4 個平行，其中，3 個平行實驗組用于生長和存活測試，另外，1 個平行水槽用于酶指標的測定，每個平行放置30 頭刺參。實驗期間，每天投喂配合飼料1 次，投喂量為刺參體重的2%，每天按時投喂并吸底清污，并更換相同鹽度的海水，換水量為50%。觀測并記錄刺參攝食、體征、生長、死亡等情況，計算各組存活率(Survival Rate, SR, %)和特定生長率(Specific Growth Rate, SGR, %/d)，測定各組刺參的呼吸代謝及非特異性免疫酶活性的差異。

1.2.1 不同鹽度條件下刺參“參優1 號”苗種特定生長率和存活率的變化 實驗開始時，稱取苗種的初始體重；實驗結束時，記錄苗種的存活數量和終末平均體重，苗種的SR 和SGR 采用以下公式計算：

式中，N0和Nt分別為刺參初始數量和終末存活數量，W0和Wt分別為刺參初始平均體重和終末平均體重(g)，t 為養殖天數。

1.2.2 不同鹽度條件下刺參“參優1 號”苗種的呼吸代謝變化 各組到達設定鹽度7 d 后，開始測定相應鹽度下刺參的呼吸代謝。實驗在2 L 呼吸瓶中進行，每個測試瓶中加入相應鹽度的海水和刺參，每個鹽度設3 個平行組，每組10 頭刺參，同時，設立3 個空白對照組(未放置刺參組)。所有呼吸瓶放入同一個水槽中，以保持相同的溫度條件(16.0℃)。每個呼吸瓶加滿相應鹽度海水和刺參后，立即用橡皮塞封口，封口后4 h，采用虹吸法自各實驗組取水樣，分別用碘量法(GB 17378.4-2007)和靛酚藍分光光度法(GB 17378.4-2007)測定水樣中溶解氧(DO)和氨氮(-H)含量，計算刺參的耗氧率(RO)和排氨率(RN)以及氧氮比(O : N)。計算公式如下：

式中，O0和Ot分別為實驗結束時對照組和實驗組水體的DO 質量濃度(mg/L)，N0和Nt分別為實驗結束時對照組和實驗組水體中總氨氮(TN)質量濃度(mg/L)，t 為實驗持續時間(h)；W 為刺參的體重(g)，V 為實驗水體體積(L)。

1.2.3 不同鹽度條件下刺參“參優1 號”苗種的非特異性免疫酶活性變化 30 d 的實驗周期內，分別在0、10、20、30 d 從各鹽度組隨機取3 頭刺參，活體解剖取體腔液，4℃條件下，5000 r/min 離心10 min，取上清液。使用南京建成生物公司的試劑盒并參照試劑盒說明書測定刺參苗種體腔液的酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

1.3 數據處理

使用GraphPad Prism 8.0 軟件繪圖，采用SPSS 18.0 對數據進行單因素方差(One-way ANOVA)分析，采用Tukey 檢驗對數據進行多重分析，P＜0.05 為不同鹽度組的相應指標差異顯著。

2 結果與分析

2.1 鹽度對刺參“參優1 號”苗種存活率的影響

實驗周期內刺參“參優1 號”苗種在不同鹽度條件下的SR 曲線見圖1。從圖1 可以看出，低鹽對苗種存活影響很大，鹽度為14 和15 實驗組的苗種在14和24 d 累計死亡率達到100%；在30 d 的養殖期內，鹽度為16～20 時，“參優1 號”苗種的SR 隨鹽度的升高而增加，苗種的 SR 由(13.33±4.71)%逐漸增加到(86.67±4.71)%；鹽度為23～40 的各實驗組SR 均為100%。

圖1 不同鹽度條件對刺參“參優1 號”苗種存活率的影響Fig.1 Effect of salinity on survival rate of sea cucumber “Shenyou No.1”

2.2 鹽度對刺參“參優1 號”苗種生長的影響

鹽度為14～16 的各實驗組，由于苗種的SR 過低，無法計算30 d 實驗周期內的SGR；鹽度為17～40 時，各實驗組“參優1 號”苗種的SGR 見圖2。從圖2 可以看出，鹽度在17～40 之間，苗種的SGR 隨鹽度的增加呈先升高后降低的趨勢。鹽度為17～20 時，苗種的SGR 為負值；鹽度為23～40 時，SGR 為正值；鹽度大于26 時，SGR 顯著增高(P＜0.05)；鹽度為29～37 時，SGR 保持較高的水平，各組之間的差異不顯著(P＞0.05)，并在鹽度為32 時達到最高，為0.9932%/d；鹽度在37～40 范圍內，SGR 隨鹽度的上升而降低。依據獲得的生長參數并通過數學函數推導，鹽度在17～40 范圍內，鹽度和刺參SGR 的關系可以用以下公式：

SGR= -0.0062S2+0.4046S-5.7849 (R2=0.9602)

根據公式推算，刺參“參優1 號”在鹽度為32.6時，SGR 最高。

圖2 不同鹽度條件下刺參“參優1 號”苗種的特定生長率Fig.2 Specific growth rate of sea cucumber“Shenyou No.1” under different salinity

2.3 鹽度對刺參“參優1 號”苗種呼吸代謝的影響

不同鹽度條件下，刺參“參優1 號”苗種的RO計算結果見圖3。從圖3 可以看出，在鹽度為14～40時，苗種隨鹽度的升高RO呈“M”型波動。鹽度在14～17 范圍內RO較低，各組間無顯著差異(P＞0.05)；鹽度高于18 時，實驗苗種的RO顯著增高(P＜0.05)；鹽度為23～29 時，RO處于較高水平，各組之間的差異不顯著(P＞0.05)；鹽度為26 時，RO達到第1 個高峰值，為0.0173 mg/(g·h)。鹽度為32 時，實驗苗種的RO顯著降低(P＜0.05)；當鹽度高于35 時，RO逐漸升高，并在鹽度為37 時達到第2 個高峰值，為0.0196 mg/(g·h)；鹽度為38～40 時，“參優1 號”苗種的RO隨鹽度的升高呈下降趨勢。

圖3 不同鹽度條件下刺參“參優1 號”苗種的耗氧率Fig.3 Oxygen consumption rate of sea cucumber“Shenyou No.1” under different salinity

不同鹽度條件下，刺參“參優1 號”苗種的RN變化見圖4。從圖4 可以看出，其變化趨勢和RO變化趨勢相似，鹽度在14～29 范圍內，隨著鹽度的升高，實驗苗種的RN逐漸增高；鹽度為23～29 時，RN達到較高的水平。其中，鹽度為26 時RN較高，為0.00185 mg/(g·h)；鹽度為32 時，RN顯著降低(P＜0.05)；在鹽度為32～37 范圍內，RN逐漸升高，并在鹽度為37 時達到峰值，為0.00196 mg/(g·h)；鹽度高于37 時，“參優1 號”的RN隨鹽度的升高呈下降趨勢。

圖4 不同鹽度條件下刺參“參優1 號”苗種的排氨率Fig.4 Ammonia excretion rate of sea cucumber “Shenyou No.1” under different salinity

不同鹽度條件下，刺參苗種O : N 值的計算結果見表1。從表1 可以看出，不同的鹽度組O : N 值均在8 左右，隨鹽度的變化無顯著差異(P＞0.05)。

表1 鹽度對刺參“參優1 號”O : N 的影響Tab.1 Effect of salinity on O : N of sea cucumber “Shenyou No.1”

2.4 鹽度對刺參“參優1 號”苗種非特異性免疫酶活性的影響

在鹽度為14～16 時，實驗結束后，苗種全部死亡，無法進行體腔液的獲取。鹽度為17 時，實驗結束后，剩余苗種數量獲得的體腔液不足以進行非特異性免疫酶活性的檢測。本研究對鹽度為18～40 各實驗組苗種的非特異性免疫酶活性進行測定，結果見圖5～圖8。

由酸性磷酸酶(ACP)的測定結果(圖5)可以看出，鹽度為18、32、35、36 的實驗組，在實驗周期內不同時間點刺參“參優1 號”苗種的ACP 活性無顯著變化(P＞0.05)，其余實驗組ACP 均呈先升高后降低的趨勢，并在第10 天時，ACP 活性達到最高，顯著高于其他時間的ACP 活性，其中，鹽度為26 的實驗組第10 天ACP 活性達到最高。

圖5 鹽度對刺參“參優1 號”體腔液酸性磷酸酶活性的影響Fig.5 Effect of salinity on ACP activity of coelomic fluid in sea cucumber “Shenyou No.1”

在30 d 實驗周期內，各鹽度組堿性磷酸酶(AKP)活性的測定結果(圖 6)可以看出，在實驗鹽度范圍內，隨著鹽度的增高，不同鹽度組同一時間實驗苗種的AKP 活性呈波浪形波動；鹽度高于18 時，AKP的活性逐漸增高，并在鹽度為23 時達到峰值，然后逐漸降低；在鹽度為32 時達到最低值；鹽度高于32時，AKP 活性逐漸上升。同一鹽度組不同時間點苗種的AKP 活性變化也存在差異，其中，鹽度為32和35 時，不同時間點AKP 活性差異不顯著，其余鹽度組隨時間的延長基本呈先升高后降低的趨勢，并在第10 天達到較高值。

圖6 鹽度對刺參“參優1 號”體腔液堿性磷酸酶活性的影響Fig.6 Effect of salinity on AKP activity of coelomic fluid in sea cucumber “Shenyou No.1”

不同鹽度條件下，刺參“參優1 號”苗種體腔液溶菌酶(LZM)活性變化見圖7。從圖7 可以看出，在實驗鹽度范圍內，隨著鹽度的增高，實驗苗種不同鹽度組在同一時間點的LZM 活性呈先升高后降低再升高的“M”型趨勢。其中，在鹽度為29、39 時，LZM 活性達到較高值；鹽度為32、35 時，LZM 的活性較低。同一鹽度組中，鹽度為18 時，LZM 活性隨著實驗時間的延長出現下降趨勢，其余各組的LZM 活性呈先升高后降低的趨勢，并在第10 天時達到較高值。

圖7 鹽度對刺參“參優1 號”體腔液溶菌酶活性的影響Fig.7 Effect of salinity on LZM activity of coelomic fluid in sea cucumber “Shenyou No.1”

各鹽度條件下，刺參苗種超氧化物歧化酶(SOD)活性變化見圖8。從圖8 可以看出，在鹽度為18～29 時，0 d 各組SOD 活性均處于最高水平，隨鹽度的增加呈先升高后降低的趨勢，并在鹽度為18～23 時，各實驗組SOD 的活性隨時間變化呈逐漸降低的趨勢；而鹽度為26 和29 的實驗組，SOD 的活性呈先降低后升高的趨勢；鹽度為32 的實驗組，SOD 活性隨時間變化無顯著差異(P＞0.05)；鹽度為36～38 時，SOD 的活性隨時間變化呈先降低后升高的趨勢，均在第20 天時達到最低，并在第30 天時又顯著上升(P＜0.05)。

圖8 鹽度對刺參“參優1 號”體腔液超氧化物歧化酶活性的影響Fig.8 Effect of salinity on SOD activity of coelomic fluid in sea cucumber “Shenyou No.1”

3 討論

3.1 刺參“參優1 號”苗種在不同鹽度條件下的適應性

鹽度作為影響海洋生物生理生態學最重要的環境因子之一，與養殖動物的滲透壓調節、生長、發育關系密切(Dong et al, 2008; Zhang et al, 2018)。棘皮動物缺乏專門的排泄器官，機體不能進行細胞外滲透壓調節，當水體鹽度變化時，刺參體內的滲透壓也會迅速變化，機體細胞通過調節氨基酸和部分離子的濃度來維持與體腔液滲透壓平衡(Talbot et al, 2002)。刺參屬于典型的狹鹽性海洋生物，鹽度的變化對刺參的生長和存活有明顯影響(陳勇等, 2007; 鄭慧等, 2014; Li et al, 2010; Hu et al, 2010)。對于選育的新品種而言，選育目標性狀決定了其在養殖業中的應用潛力，而新品種生態適應性則決定了其推廣范圍和區域。刺參“參優1 號”是以抗燦爛弧菌(Vibrio sp lendidus)能力和生長速度為選育目標培育出的刺參新品種，為獲得最大的良種貢獻率，需要對該品種的生態適應范圍進行重新評估。

刺參機體對鹽度的調節有一個安全閾值，超過這個閾值會影響其生存。本研究結果顯示，鹽度為18 以下，刺參“參優1 號”的SR 會大幅度降低，這可能就是由于鹽度超過了其自身調節范圍導致。龔海濱等(2009)和張少華等(2004)通過SR 測算和生理狀態觀察的方法，確定了急性鹽度驟變條件下，刺參的適宜鹽度分別為20～35 和18～39，最適生長鹽度為25～30。當水體鹽度在等滲點附近時，機體用于滲透壓調節的能量較少，更有利于刺參的生長和幼體的發育(Asha et al, 2005)。本研究發現，刺參“參優1 號”在鹽度約為32 時SGR 最高，這可能是由于鹽度為32 是刺參等滲點的附近，用于滲透壓調節的能量較少，故生長速度最快。本研究通過鹽度緩降后30 d 的養殖結果表明，刺參“參優1 號”的存活鹽度為23～40，最適生長鹽度為29～37。王吉橋等(2009)研究了60 d 實驗周期內，鹽度驟變對刺參幼參存活和生長的影響，提出采用存活鹽度和抑制生長鹽度2 個概念表示刺參的耐鹽性，得出鹽度為26 是明顯的抑制生長的拐點，刺參幼參的存活鹽度為26～33，生長適宜鹽度為30～33。胡煒等(2012)通過測定逐步降鹽(鹽度緩降)和鹽度突變(鹽度驟降)2 種實驗模式下，鹽度對刺參生存、攝食和生長的影響時發現，影響刺參攝食和生長的關鍵是低鹽脅迫的最終鹽度而不是改變鹽度方式。本研究所測得的刺參“參優1 號”的鹽度耐受和適宜鹽度范圍與王吉橋等(2009)研究結果基本一致，說明刺參“參優1 號”在選育過程中的鹽度耐受適應性未發生顯著變化，而本研究所得到的結果范圍明顯小于龔海濱等(2009)和張少華等(2004)的研究結果。一方面是由于本研究測定周期長(30 d)，遠高于前2 項研究(分別為168 和48 h)的監測時間，另一方面也是由于本研究除了考慮存活率，同時，將生長率作為判定其最適鹽度的指標，導致的結果范圍顯著偏小。

3.2 刺參“參優1 號”在不同鹽度條件下的呼吸代謝特征

鹽度的變化會對刺參造成脅迫反應，進而影響刺參的能量代謝，表現為呼吸和排泄的不同。水生動物處于等滲點時RO最低，可能是動物處于等滲點用于滲透壓調節的耗能最少。汪洋(2013)對南移刺參在鹽度為20～35 條件下的呼吸代謝測定結果表明，隨著鹽度的升高，刺參的RO和RN均呈先降低再升高的趨勢，且均在鹽度為30 時達到最低。包杰(2008)研究了在鹽度為23～38 條件下，不同規格青刺參和紅刺參呼吸代謝的變化發現，在所測試的鹽度范圍內，刺參的RO和RN變化呈“M”型趨勢，并依據這一趨勢得出鹽度為29～32 是青刺參和紅刺參的最適鹽度范圍；袁秀堂等(2006)對不同規格刺參的鹽度呼吸代謝測定表明，鹽度為31.5 時，不同規格刺參的RO和RN均最低。本研究結果表明，刺參“參優1 號”的RO和RN也以鹽度為32 呈波谷的“M”型趨勢，在低于和高于等滲點苗種的RN均升高，這可能是由于鹽度脅迫帶來的滲透壓調節需要較多游離氨基酸分解導致，同時，也說明鹽度為32 可能最接近刺參“參優1 號”的體液等滲點。這與前幾項的研究結果相一致，具體等滲點數值的差異應該是因為各研究在具體實驗方法中設置的鹽度差異不同引起的。將RO和氮排泄結合起來計算代謝的O : N 值，可以評估無脊椎動物的能量需求和對營養物質的利用特性并被用作其對環境脅迫指標(Bayne et al, 1978)。本研究結果表明，鹽度對刺參“參優1 號”的O : N 值的影響不顯著，與袁秀堂等(2006)和薛素燕等(2009)研究結果相一致，而與包杰(2008)對青刺參和紅刺參的研究結果表明，不同品系刺參O : N 值隨鹽度的變化趨勢不同，這可能是跟刺參品系差異有關。

3.3 刺參“參優1 號”苗種在不同鹽度條件下的非特異性免疫酶活性特征

刺參體腔液細胞是其非特異性免疫系統的承擔者，體腔液細胞可產生多種免疫因子及免疫酶(Coteur et al, 2002; Kudriavtsev et al, 2004; 葉海斌等, 2018)，因此，可以通過檢測體腔液細胞中非特異性免疫酶活性的變化來反應其應對各種脅迫狀態下的免疫應答(田青等, 2014; 徐松濤等, 2017; 韓莎等, 2018)。本研究結果表明，鹽度變化顯著影響了刺參“參優1 號”的非特異性免疫酶指標。對相同鹽度30 d 實驗期內酶指標的測定結果可以看出，在鹽度脅迫下，SOD 活性的峰值一般在0 d 出現，而ACP、AKP 活性的峰值在第10 天出現，LZM 活性的峰值在10～20 d 出現，表明體腔細胞在應對鹽度變化的過程中，不同酶指標變化響應時間存在一定差異。相應酶指標對鹽度變化在時間上的響應規律與鄭慧等(2014)的研究結果一致。但與田青等(2014)檢測饑餓脅迫、徐松濤等(2017)檢測氨氮脅迫和韓莎等(2018)檢測pH 脅迫條件下的響應變化規律存在顯著差異，這說明刺參在應對不同脅迫條件下，非特異性免疫酶活性的變化存在很大差異。對不同鹽度條件下所檢測酶指標活性對比結果可以看出，在鹽度為18 條件下，各酶指標的活性都顯著低于其他鹽度組，表明在苗種受到致死鹽度脅迫時，機體已無法正常維持其免疫酶活性的調節能力，這與侯西坦等(2016)的研究結果相一致。而在刺參能存活的23～40 鹽度范圍內，相應酶指標的變化均表現為在適宜鹽度內活性較低，而應對低鹽或高鹽脅迫時活性顯著升高，表明在受到鹽度脅迫后刺參會產生一種應激和保護反應，通過提高非特異性免疫酶活性以增強免疫力。

綜上所述，在刺參“參優1 號”苗種養殖生產過程中，應保持水體鹽度在29～37 范圍內，苗種生長速度較快，鹽度過高或過低均會引起刺參的應激反應，生理表現為RO和RN升高并引發機體免疫酶活性的變化，對苗種的生長產生不利影響。因此，在良種推廣過程中，應根據海域自然鹽度條件選擇適宜的推廣區域，該新品種在刺參池塘養殖過程中要避免暴雨、結冰等天氣造成的鹽度波動。本研究結果可為良種在不同模式、不同海域的推廣提供科學依據。