瘤胃液對全株甜高粱青貯質量的影響

任海偉，盧娜娜，路力榕，孫文麗，王治業，李金平,3,4，李志忠

瘤胃液對全株甜高粱青貯質量的影響

任海偉1,2,3，盧娜娜1，路力榕1，孫文麗1，王治業2，李金平1,3,4，李志忠1※

（1. 蘭州理工大學生命科學與工程學院/西部能源與環境研究中心，蘭州 730050； 2. 甘肅省科學院生物研究所，蘭州 730000；3. 甘肅省生物質能與太陽能互補供能系統重點實驗室，蘭州 730050；4. 西北低碳城鎮支撐技術協同創新中心，蘭州 730050）

甜高粱是一種重要的能源作物，為實現長時間貯存并提升糖化效率，該研究分析了瘤胃液不同添加量對全株甜高粱青貯品質和酶解糖化效果的影響。設置R1、R3、R5和R7共4個瘤胃液處理組（添加量依序分別為1、3、5和7 mL/100 g原料）和1個對照組（CK，等量蒸餾水），考察了瘤胃液不同添加量對全株甜高粱青貯過程中有機組分、發酵品質和酶解性能等質量指標的動態影響，并跟蹤解析青貯期間微生物菌群的動態演繹。結果表明，添加瘤胃液能明顯減少青貯甜高粱中的干物質、水溶性碳水化合物、粗蛋白以及木質纖維組分含量，使青貯pH和氨氮含量顯著下降（<0.05），并與瘤胃液添加量呈負相關。青貯中的乳酸、乙酸含量隨瘤胃液添加量和青貯發酵時間延長而明顯增加（<0.05），瘤胃液強化了青貯發酵并有助于減少干物質損失，尤其在較高添加量時，青貯60 d時的甜高粱綜纖維素含量反而有所增加。4種瘤胃液處理組的門水平優勢細菌主要為厚壁菌和變形菌，厚壁菌相對豐度隨時間延長和瘤胃液添加量的增加而逐漸增加，變形菌門豐度則逐漸下降；屬水平主要以乳酸桿菌、泛菌和醋酸桿菌為主，乳酸桿菌豐度與時間、瘤胃液添加量呈正相關，而泛菌則呈減少趨勢。瘤胃液強化青貯后的甜高粱還原糖得率顯著提升，尤其瘤胃液添加量為7 mL/100 g的R7處理組的糖得率較原料分別提高了11.06%（30 d）和19.28%（60 d）。添加瘤胃液能有效改善青貯甜高粱的發酵質量和生物降解性能，起到生物強化的預處理作用，為甜高粱的乙醇化利用奠定了基礎。

甜高粱；青貯質量；瘤胃液；微生物菌群；酶解糖化

0 引 言

甜高粱又稱糖高粱，是一種具有優良生長特性的C4“高能植物”，具有生長速度快、高光合作用、耐旱澇、耐鹽堿、耐瘠薄等優點[1]。甜高粱常被用于生產動物飼料、生物能源、生物材料等，但由于甜高粱收獲的季節性、時效性等特點，只有及時高效貯存才能減少采后植株水分和養分的損失，抑制莖稈木質化，并實現原料的周年可持續供給[2]。另一方面，甜高粱莖稈含有大量纖維素、半纖維和木質素等組分，形成天然的抗降解屏障網絡結構，大大限制了生物降解性能，進而影響生物能源制備的生化轉化效率[3]。

青貯不僅能通過濕法保存技術實現生物質原料的跨季節貯存，還對木質纖維生物質有一定預處理作用[4]。研究表明，添加微生物菌劑、酶制劑等外源生物制劑能有效改善青貯發酵品質，提高木質纖維組分的降解和轉化利用效率。Nkosi等[5]發現甜高粱青貯過程中添加植物乳桿菌和酶制劑（纖維素酶與半纖維素酶復合）能顯著提高乳酸濃度，降低pH值、丁酸、氨氮和纖維組分含量。Li等[6]發現產阿魏酸酯酶乳酸菌和纖維素酶能提高玉米秸稈青貯質量，并促進纖維素轉化效率。Zhang等[7]認為添加植物乳桿菌與纖維分解菌能有效促進玉米青貯發酵進程，提高木質纖維降解速率。然而，由于青貯體系中的木質纖維降解菌群相對較少且不專一，致使青貯過程兼具的內源性生化預處理作用相對較弱，對木質纖維結構解聚和組分優化效果較為有限[8]。若能在甜高粱青貯過程中導入適宜的外源生物轉化系統來強化木質纖維分解，則對提高其生化轉化效率具有積極作用。

“鮮活”的反芻動物瘤胃液棲息有大量天然微生物菌群（主要包括普氏桿菌、瘤胃球菌等纖維分解菌，以及溶纖維丁酸弧菌、嗜淀粉瘤胃桿菌等蛋白降解菌）及其代謝酶系（纖維素酶、半纖維素酶和蛋白酶等），是一類能有效克服木質纖維屏障的天然特異性“生物處理系統”[9]。稻草經瘤胃液生物強化處理后，木質纖維組分含量顯著下降，產甲烷量增加83%，纖維素降解時間縮短40%[10]。玉米青貯過程中添加瘤胃真菌CN6 CGMCC能顯著降低pH值以及乙酸、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量，提高乳酸、粗蛋白和可發酵糖含量[11]?？梢?，反芻動物瘤胃微生物在青貯發酵過程中能發揮生物強化作用。而且，瘤胃液還具有與青貯過程耦合協同的環境基礎（如厭氧、低pH值等）、物質基礎（有機酸）和代謝紐帶[12]。鑒此，本文將肉牛瘤胃液作為一種外源生物活性添加劑用于甜高粱青貯過程，著重從有機成分、木質纖維組分、發酵品質、酶解特性等方面探究添加不同劑量瘤胃液對青貯質量和生物降解性能的影響，并結合微生物菌群分析瘤胃液強化青貯的作用機理，擬為甜高粱青貯和能源化利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 試驗材料

全株青綠甜高粱取自中科院近代物理研究所武威種植基地，切碎至2～3 cm備用；肉牛瘤胃液取自武威頂樂生態牧業有限公司，冷凍保存、活化后備用。甜高粱與瘤胃液的主要化學指標如表1所示。

表1 全株甜高粱和瘤胃液的理化指標

注：FW，鮮質量；DM，干物質。纖維素酶活力以濾紙酶活性 (FPU)表示。下同。

Note: FW, fresh weight; DM, dry matter. Cellulase activity was expressed based on the filter paper cellulase activity unit (FPU). The same below.

1.1.2 儀器與設備

F800全自動纖維分析儀測定，山東海能科學儀器有限公司；K9840半自動凱氏定氮儀，山東海能科學儀器有限公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀，安捷倫科技公司。

1.2 青貯試驗設計與取樣

準確稱量30份1.5 kg切碎的甜高粱，分別將活化后的肉牛瘤胃液按照1、3、5和7 mL/100 g原料的劑量均勻噴灑至表面，迅速混勻后裝入塑料桶中密封，4個瘤胃液青貯組分別命名為R1、R3、R5和R7?？瞻讓φ战M（CK）噴灑等體積蒸餾水，每個試驗組3個平行，置于（20±2）℃恒溫環境青貯發酵60 d，并分別于30和60 d時進行質量分析，青貯樣品取樣與浸提液制備方法參考文獻[13]進行。

1.3 青貯質量分析

干物質（Dry Matter，DM）測定采用105 ℃烘干恒重法；水溶性碳水化合物（Water Soluble Carbohydrates，WSC）測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法；粗蛋白（Crude Protein，CP）測定采用凱氏定氮法；氨氮（Ammonia Nitrogen，AN）采用苯酚-次氯酸鈉分光光度法；中性洗滌纖維（Neutral Detergent Fiber，NDF）、酸性洗滌纖維（Acid Detergent Fiber，ADF）和酸性洗滌木質素（Acid Detergent Lignin，ADL）測定采用全自動纖維分析儀；纖維素（Cellulose，CL）、半纖維素（Hemicellulose，HC）和綜纖維素（Holocellulose，HoC）含量計算參考文獻[13]。干物質損失率（Dry Matter Loss，LDM）計算公式為

式中DM為干物質含量，g/kg FW。

青貯浸提液pH值測定采用UB-7酸度計；乳酸由（Lactic Acid，LA）、乙酸（Acetic Acid，AA）、丙酸（Propionic Acid，PPA）、丁酸（Butyric Acid，BA）等有機酸分析測定采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），測試條件參考Li等[6]文獻報道。

1.4 青貯發酵過程的微生物菌群分析

參照文獻[13]中的方法，使用試劑盒提取青貯樣品中的總DNA，然后進行16S rRNA 基因的PCR擴增，擴增區域為 16SrRNA (V3+V4) 區，擴增產物經純化、定量和均一化后形成測序文庫，委托北京百邁客生物科技有限公司Illumina HiSeq 2500測序。測序結果與NCBI基因庫進行比對，按照97%相似性水平劃分操作分類單元（OTU），采用QIIME軟件計算Shannon和Chao1指數等Alpha多樣性指數，選取相對豐度高于0.1%的細菌類群進行門、屬水平菌群分析。

1.5 酶解糖化試驗

準確稱取0.5 g甜高粱原料或青貯樣品于50 mL離心管，以1:20（g/mL）料液比加入檸檬酸緩沖液（pH值4.8，0.05 mol/L），再依次添加纖維素酶（1 000 U/g）、半纖維素酶（500 U/g）、-葡聚糖苷酶（1 U/g），密封后于150 r/min條件下恒溫（50±0.5）℃振蕩酶解72 h。間隔12 h取樣，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定還原糖濃度。每個樣品3次平行，對照組用等體積蒸餾水代替酶液。還原糖得率的計算公式[14]為

式中RSY為還原糖得率，mg/g DM；為酶解液中還原糖濃度，g/mL；為酶解液體積，mL；為酶解底物質量，g；0.9為換算系數。

1.6 數據分析

所有數據用平均值±標準差表示，經Excel 2007 軟件整理原始數據后采用 SPSS 20.0和Origin 9.0軟件進行統計分析并制作圖表。對不同處理組數據進行單因素和一般線性模型分析，<0.05代表數據差異顯著，>0.05代表數據差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 添加瘤胃液對青貯期間主要有機組分影響

2.1.1 干物質含量

由圖1可知，與原料相比，5個青貯試驗組（CK、R1、R3、R5和R7組）的干物質含量均隨青貯時間延長和瘤胃液添加量的增加而顯著降低（<0.05），且存在明顯劑量效應。Borreani等[15]認為生物質青貯后的干物質含量越高，說明營養物質的損失越少，發酵品質越好。本試驗中青貯甜高粱干物質含量顯著下降的主要原因在于，一方面，常規青貯發酵過程中以優勢乳酸菌為主的微生物菌群所參與的生化反應過程需要消耗大量可溶性糖、蛋白質等營養物質作為代謝底物，并產生CO2和揮發酸等物質[15]。另一方面，青貯甜高粱中原本分解相對緩慢的纖維素、淀粉等營養物質很容易被瘤胃液中的纖維分解菌、淀粉分解菌等厚壁菌群及其酶系所分解，從而加劇干物質損失[16]。但值得注意的是，4個添加劑組的干物質損失率均低于CK組（表2）?？梢?，添加瘤胃液進行強化青貯有助于更好地減少干物質損失，且高劑量瘤胃液對抑制干物質損失的效果更明顯。

表2 瘤胃液添加量對干物質損失率的影響

2.1.2 水溶性碳水化合物含量

如圖2所示，與青貯前原料（192 g/kg DM）相比，整個發酵期間青貯甜高粱的水溶性碳水化合物（Water Soluble Carbohydrates，WSC）含量均明顯下降，且隨時間延長而呈現顯著下降趨勢（<0.05）。這主要是因為在發酵過程中，WSC作為微生物菌群繁殖代謝的重要底物被乳酸菌群等有益菌發酵生成乳酸、乙酸等揮發酸產物所致[17]。另一方面，青貯發酵30和60 d時，4個添加劑組的WSC含量均顯著低于CK組，且隨著瘤胃液添加量的增加而顯著降低（除60 d時R7組，<0.05）。這是因為添加瘤胃液后會引入常規青貯體系中所缺少的黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌等木質纖維分解菌群，進而加速可溶性糖的代謝利用[18]。然而，當瘤胃液添加量處于較高劑量時，甜高粱青貯中所含的淀粉、纖維素等大分子碳水化合物又會被瘤胃微生物菌群及其酶系共同作用，降解生成一定量的可溶性糖，從而使糖含量處于動態平衡狀態[16]?？傊?，青貯發酵時間的延長以及瘤胃液添加量的增加均顯著降低了全株甜高粱青貯中的水溶性碳水化合物含量。

2.1.3 粗蛋白含量和木質纖維組分

粗蛋白（CP）也是評價青貯品質優劣的重要指標，青貯期間蛋白質損失主要緣于植物蛋白酶、微生物菌群及其酶系引起的分解作用[19]。由表3可知，除R7組外，CK、R1、R3和R5組的粗蛋白含量均隨發酵時間延長而顯著降低（<0.05）。同時，由于強化青貯體系中存在溶纖維丁酸弧菌、嗜淀粉瘤胃桿菌等瘤胃微生物及其消化酶系的降解作用，使整個青貯期間蛋白質含量隨瘤胃液劑量增加而呈顯著下降趨勢，并存在劑量效應[20]。說明過長時間的青貯發酵和較高瘤胃液添加量均不利于粗蛋白的保存。

木質纖維組分的構成及含量高低也是影響甜高粱生物降解潛力和生化轉化的重要因素。如表3所示，與原料相比，5個試驗組的酸性洗滌纖維（ADF）、中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌木質素（ADL）含量均顯著下降，且三者含量均隨發酵時間延長而顯著降低（除個別組）。這3種組分共同構成了復雜的木質纖維抗降解屏障結構，經過長時間的酸性青貯環境、微生物菌群及其酶系的共存作用使其結構軟化，進而導致纖維素和半纖維素含量的聯動變化[13]。由于甜高粱細胞壁的纖維素和半纖維素組分被瘤胃液中的瘤胃球菌、普氏桿菌等纖維素降解菌及其分泌酶所降解，使二者含量與發酵時間呈負相關（瘤胃液添加量<3%時）[21]，但瘤胃液添加量較高時，二者含量則隨時間延長保持不變。Baba等[22]也發現適宜的青貯條件和瘤胃液添加量有利于木質纖維素的降解。另一方面，隨著瘤胃液添加量的增加，青貯期間ADF、ADL和NDF等木質纖維組分的含量也呈顯著下降趨勢，而較低含量的ADF、ADL和NDF有助于提高消化降解率[13]。青貯發酵60 d時，R3和R5組的綜纖維素含量均顯著高于CK組（<0.05），說明通過長時間、添加較高劑量瘤胃液的強化青貯過程有助于保存甜高粱中的能量物質綜纖維素。

總之，青貯時間、瘤胃液添加量以及二者交互作用對粗蛋白、木質纖維組分均有極顯著影響。

表3 青貯過程中不同添加量瘤胃液對粗蛋白和木質纖維組分的動態影響

注：*<0.05，影響顯著；**<0.01，影響高度顯著；***<0.001，影響極顯著。下同。

Note: *<0.05, significant effects; **<0.01, very significant effects; and **<0.001, extremely significant effects. The same below.

2.2 青貯期間發酵品質的動態變化

pH值的迅速下降是成功青貯并獲得高品質青貯的關鍵。如表4所示，發酵30 d時，CK組的pH值下降至4.52，瀕臨青貯腐敗變質的臨界值；而4個瘤胃液處理組的pH值則下降迅速且均低于4.0，尤其高劑量R7組的pH值為3.55，處于優良青貯范圍[23]。青貯發酵pH值的下降主要歸因于微生物菌群代謝產生的乳酸和乙酸等有機酸累積，其中乳酸對pH值下降的貢獻度相對較高，因為乳酸的酸度系數（pKa=3.86）低于乙酸（pKa=4.77）。另一方面，各試驗組的pH 值均隨著青貯時間的延長而呈顯著下降趨勢，Xing等[24]也有類似研究報道。

表4 不同處理時添加瘤胃液對青貯發酵品質的動態影響

乳酸和乙酸是青貯發酵過程中微生物菌群產生的重要有機酸，二者含量均隨時間延長而顯著增加，這與pH值變化趨勢相一致。同時，4個添加劑處理組的乳酸、乙酸含量均顯著高于CK組，且均隨瘤胃液添加量的提高而顯著增加，青貯發酵60 d時，乳酸和乙酸含量高達9.42 g/kg DM（R7）和 29.08 g/kg DM（R5），這是因為反芻動物瘤胃液中含有豐富的細菌、真菌、原蟲等微生物菌系，能有效分解木質纖維組分和淀粉并將其轉化為可發酵糖，從而和原料本身所含的可發酵糖一起供有益乳酸菌群發酵代謝，產生更多的乳酸[16]。乙酸含量的增加主要歸因于瘤胃液自身所含的泛菌、乙酸桿菌和葡糖桿菌等產乙酸菌群。此外，個別試驗組檢測出微量丙酸，而丁酸未檢出，說明整體青貯品質良好。

氨氮含量是評價蛋白質分解的重要指標，氨氮含量越高說明蛋白質分解越嚴重，優質青貯一般不超50 g/kg TN[25]。由表4可知，青貯發酵期間，4個添加劑處理組的氨氮值都遠低于50 g/kg TN，且均顯著低于CK組，這得益于較低pH值的酸性青貯環境和高含量的乙酸等抗真菌物質。

總體而言，添加瘤胃液能顯著降低青貯甜高粱的pH值和氨氮含量，增加乳酸和乙酸含量，進而提高發酵品質。

2.3 青貯過程中的細菌多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性指數

Alpha多樣性即為物種多樣性，Chao1和ACE指數反映了微生物群落物種種類的豐富度；Shannon和Simpson指數反映了細菌群落多樣性[26]。如表5所示，4個添加劑處理組的Chao1、ACE和Shannon指數均明顯高于原料和CK組，Simpson指數顯著低于原料，說明添加瘤胃液使青貯甜高粱體系中的微生物菌群與原料相比更豐富且多樣化。此外，隨著青貯時間的延長，4個添加劑處理組的Shannon指數顯著降低，Simpson指數顯著增加，說明細菌群落多樣性隨青貯時間延長而下降，因為發酵過程中乳酸菌逐漸演變為青貯體系中的優勢菌群，青貯60 d時的乳酸菌群豐度介于45%～81%范圍，也印證了這一點?？梢?，添加瘤胃液有助于強化青貯發酵體系中細菌群落豐富度和多樣性。

表5 不同瘤胃液添加量時的Alpha多樣性

2.3.2 門分類水平細菌群落組成

由圖3可知，原料甜高粱表面附著的門水平優勢細菌主要為變形菌（Proteobacteria，93.49%），還含有少量放線菌（Actinobacteria，4.46%）和厚壁菌（Firmicutes，2.00%）。青貯發酵后細菌群落發生了不同的演變趨勢，其中CK組仍以變形菌門為主，相對豐度在30 d和60 d時分別達到96.1%和81.2%，而4個瘤胃液強化青貯處理組則演繹形成了變形菌和厚壁菌共存的微生態結構。而且，隨著青貯時間的延長和瘤胃液添加量的增加，厚壁菌門相對豐度逐漸增加，變形菌門相對豐度逐漸下降，尤其在60 d時R7組中的厚壁菌門相對豐度高達84.84%，這可能是因為優勢乳酸菌群隸屬于厚壁菌門所致。同時，瘤胃液自身也含有較為豐富的厚壁菌（相對豐度61.12%），兩方面因素共同作用使厚壁菌們變得更加豐富[27]。再者，有研究發現，青貯發酵過程和低pH環境也有助于促進厚壁菌生長，抑制變形菌繁殖[28]。另外，整個青貯發酵期間，4個添加劑組的厚壁菌門相對豐度均顯著高于CK組，說明添加瘤胃液對青貯發酵的微生物群落結構有很大影響，這與Zhao等[29]研究結果一致。

2.3.3 屬分類水平細菌群落組成

如圖4所示，甜高粱原料表面附著的屬水平優勢菌群主要為泛菌（，35.78%）和假單孢桿菌（，13.27%），此外還含有少量鞘氨醇單孢菌（，8.46%）、微桿菌（，4.34%）和不動桿菌（，2.36%）等。經青貯發酵后，5個試驗組的屬水平細菌種群明顯增多，其中CK組含有較為豐度的泛菌（41.75%）、葡糖桿菌（，30.54%）和腸桿菌（，15.61%）等微生物類群。4個瘤胃液強化青貯組的優勢菌群演變為乳酸桿菌（）、泛菌和醋酸桿菌（），同時還包括少量瘤胃球菌（）、腸桿菌（）、沙雷氏菌（）等28個屬。

另一方面，青貯發酵30 d時，隨著瘤胃液添加量的增加，乳酸菌和醋酸桿菌的富集量分別為18.2%～46.2%和3.61%～18.0%。而隨著青貯時間的延長，5個試驗組中的泛菌、醋酸桿菌相對豐度均顯著降低，而乳酸桿菌的相對豐度則顯著增加，尤其青貯發酵60 d時乳酸桿菌的相對豐度隨瘤胃液添加量急劇增加，由45.2%（R1）增加到81.1%（R7），Gallagher等[30]研究結果也有類似發現。同時，4個添加劑處理組的乳酸桿菌和瘤胃球菌的相對豐度均顯著高于CK組，且隨著瘤胃液添加量的提高而顯著增加；而腸桿菌、泛菌、沙雷氏菌和志賀氏菌等不良微生物菌群的相對豐度明顯低于CK組，說明添加瘤胃液不僅能促進有益乳酸菌群的發酵并為其提供良好生長環境，而且還有助于抑制不良微生物。

2.4 酶解糖化分析

酶解糖化是評價生物降解性能的常用方法[6]。如圖5所示，甜高粱原料和青貯甜高粱的還原糖得率均隨著酶解時間延長而顯著增加，青貯發酵30 d時，各處理組的還原糖產量分別比甜高粱原料提高26% (CK)、30% (R1)、34% (R3)、40% (R5)和44% (R7)，且青貯處理組的還原糖得率均明顯高于對照組。這可能是因為青貯能改變木質纖維生物質的微觀結構與宏觀組成，并打破纖維素-半纖維素-木質素的網絡結構，增加纖維素和半纖維素對水解酶的可及面，從而釋放出較多的可發酵單糖[6]。

另一方面，與對照CK組相比，由于瘤胃液中瘤胃球菌、普氏桿菌等纖維素降解菌及其分泌酶對頑固的木質纖維生物質具有較高的降解能力，能有效分解木質纖維組分和淀粉并將其轉化為可發酵糖，因此4個瘤胃液處理組在72 h時的還原糖得率顯著提高[31]。無論青貯發酵時間為30或60 d，R7組的還原糖得率均達到最大值，分別為730.3 mg/g DM和795.4 mg/g DM，分別比對照組增加了11%和19%；同時也優于Zhao等[32]和Botella等[33]分別采用蒸汽爆破和可逆酸預處理甜高粱的酶解糖化結果。孟堯等[34]也認為瘤胃液添加量越高，玉米秸稈的水解率越高?？梢?，瘤胃液強化青貯能顯著提高甜高粱的還原糖得率，且與瘤胃液添加量呈正相關；這與理論計算得出的生物降解潛力變化趨勢也基本一致（圖6）。因此，較高的瘤胃液添加量有助于釋放青貯甜高粱中的可發酵糖分，在青貯發酵過程中起到明顯的生物強化預處理作用。

3 結 論

1）添加瘤胃液顯著降低了青貯甜高粱中的木質纖維組分含量，增加了乳酸菌等有益微生物的相對豐度，改善了乳酸和乙酸等發酵強度，乳酸和乙酸含量在青貯發酵60 d時高達9.42 g/kg DM（R7）和29.08 g/kg DM（R5），從而降低青貯體系pH值（低于4.0）和氨氮含量（低于50 g/kg TN），獲得高質量青貯品質。

2）較高劑量的瘤胃液生物強化作用和長時間青貯發酵，有助于破壞甜高粱莖稈的木質纖維抗降解屏障結構，減少木質素組分，釋放更多綜纖維素，獲得較高的酶解糖化得率，青貯發酵30 d和60 d時，R7組的還原糖得率分別高達730.3 mg/g DM和795.4 mg/g DM。

甜高粱青貯過程中加入瘤胃液進行生物強化，使其青貯質量和降解性能均得到了顯著改善，是實現甜高粱保質貯存和轉化利用的一種有效方式。結合生產實際，本文推薦瘤胃液添加量為100 g新鮮全株甜高粱原料中加入7 mL瘤胃液。下一步，課題組還將繼續從瘤胃液中分離一系列降解性能較高的微生物菌系進行有針對性地靶向研究，進而開發出作用明顯、適用性更強的生物強化青貯用微生物菌劑。

[1]陳朝儒，王智，馬強，等. 甜高粱莖汁及莖渣同步糖化發酵工藝優化[J]. 農業工程學報，2016，32(3)：253-258.

Chen Chaoru, Wang Zhi, Ma Qiang, et al. Optimization of ethanol production from bagasse and juice of sweet sorghum stem by simultaneous saccharification and fermentation[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2016, 32(3): 253-258. (in Chinese with English abstract)

[2]梅曉巖，劉榮厚，曹衛星. 植物生長調節劑對甜高粱莖稈貯藏中糖分變化的影響[J]. 農業工程學報，2012，28(15)：179-184.

Mei Xiaoyan, Liu Ronghou, Cao Weixing. Effects of pretreatment of sweet sorghum stalk with plant growth regulator on its sugar content during storage[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2012, 28(15): 179-184. (in Chinese with English abstract)

[3]G??b L, Sowiński J, Chmielewska J, et al. Comparison of the energy efficiency of methane and ethanol production from sweet sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) with a variety of feedstock management technologies[J]. Biomass and Bioenergy, 2019, 129: 105332.

[4]Zhao J, Dong Z H, Li J F, et al. Ensiling as pretreatment of rice straw: The effect of hemicellulase andplantarum on hemicellulose degradation and cellulose conversion[J]. Bioresource Technology, 2018, 266: 158-165.

[5]Nkosi B D, Vadlani P V, Brijwani K, et al. Effects of bacterial inoculants and an enzyme on the fermentation quality and aerobic stability of ensiled whole-crop sweet sorghum[J]. South African Journal of Animal Science, 2012, 42(3): 232-240.

[6]Li F H, Ding Z T, Ke W C, et al. Ferulic acid esterase-producing lactic acid bacteria and cellulase pretreatments of corn stalk silage at two different temperatures: Ensiling characteristics, carbohydrates composition and enzymatic saccharification[J]. Bioresource Technology, 2019, 282: 211-221.

[7]Zhang F, Wang X, Lu W, et al. Improved quality of corn silage when combining cellulose-decomposing bacteria andbuchneri during silage fermentation[J]. BioMed Research International, 2019,4361358.

[8]劉晶晶，高麗娟，師建芳，等. 乳酸菌復合系和植物乳桿菌提高柳枝稷青貯效果[J]. 農業工程學報，2015，31(9)：295-302.

Liu Jingjing, Gao Lijuan, Shi Jianfang, et al. Lactic acid bacteria community andimproving silaging effect of switchgrass[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2015, 31(9): 295-302. (in Chinese with English abstract)

[9]Yue Z B, Li W W, Yu H Q. Application of rumen microorganisms for anaerobic bioconversion of lignocellulosic biomass[J]. Bioresource Technology, 2013, 128: 738-744.

[10]Zhang H, Zhang P, Ye J, et al. Improvement of methane production from rice straw with rumen fluid pretreatment: A feasibility study[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2016, 113: 9-16.

[11]Wang D, Zhao C, Liu S M, et al.Effects ofsp. CN6 CGMCC 14449 on fermentation quality, nutrient composition and the in vitro degradation rate of whole crop maize silage[J]. AMB Express, 2019, 9(1): 121-129.

[12]孟堯. 玉米秸稈厭氧發酵瘤胃仿生工藝研究[D]. 北京：清華大學，2016.

Meng Yao. Study on Bionic Technology of Maize Straw Anaerobic Fermentation Rumen[D]. Beijing: Tsinghua University, 2016. (in Chinese with English abstract)

[13]任海偉，王莉，朱朝華，等. 白酒糟與菊芋渣混合青貯發酵品質及微生物菌群多樣性[J]. 農業工程學報，2020，36(15)：235-244.

Ren Haiwei, Wang Li, Zhu Zhaohua, et al. Ensiling co-fermentation quality and microbial community diversity of grain stiller and inulin processing residue from[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(15): 235-244. (in Chinese with English abstract)

[14]Wang W Z, Zhang L, Xu T F, et al. Improving lignocellulose enzymatic saccharification in a bioreactor with an applied electric field[J]. Industrial Crops & Products, 2017, 109: 404-409.

[15]Borreani G, Tabacco E, Schmidt R J, et al. Silage review: Factors affecting dry matter and quality losses in silages[J]. Journal of Dairy Science, 2018, 101(5): 3952-3979.

[16]周斐然. 甜高粱青貯有氧穩定性、瘤胃降解率及其對瘤胃菌群影響的研究[D]. 阿拉爾：塔里木大學，2017.

Zhou Feiran. Effects of Sweet Sorghum Silage on Sumen Degradation, Aerobic Stability and Ruman Flora[D]. Alar: Tarim University, 2017. (in Chinese with English abstract)

[17]張旭，郭盼盼，金錫九，等. 不同溫度條件下發酵時間對完全混合發酵日糧（TMF）發酵品質的影響[J]. 中國畜牧獸醫，2018，45(3)：673-681.

Zang Xu, Guo Panpan, Jin Xijiu, et al. Effects of fermentation time on fermentation quality of the Total Mixed Fermentation Ration (TMF) at different fermentation temperature[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2018, 45(3): 673-681. (in Chinese with English abstract)

[18]買爾哈巴·艾合買提. 瘤胃中纖維素分解菌的分離、鑒定及其在青貯飼料中的應用研究[D]. 烏魯木齊：新疆大學，2013.

Marhaba·Ahmet. Study on Isolation and Identification of Cellulose-degrading Bacteria from Rumen and Its Application on Silage[D]. Urumchi: Xinjiang University, 2013. (in Chinese with English abstract)

[19]李蕎蕎，王曙陽，董妙音，等. 甜高粱青貯飼料中乳酸菌最佳添加劑量的探討[J]. 中國釀造，2019，38(3)：160-165.

Li Qiaoqiao, Wang Shuyang, Dong Miaoyin, et al. Discussion on the optimum addition of lactic acid bacteria in sweet sorghum silage[J]. China Brewing, 2019, 38(3): 160-165. (in Chinese with English abstract)

[20]吳建民，王雍，周協琛，等. 基于宏基因組學解析瘤胃微生物調節荷斯坦奶牛乳蛋白含量的研究[J]. 動物營養學報，2020，32(8)：3843-3855.

Wu Jianmin, Wang Yong, Zhou Xiechen, et al. Rumen microorganism regulating milk protein content in holstein dairy cows based on metagenomic analysis[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2020, 32(8): 3843-3855. (in Chinese with English abstract)

[21]Li F, Zhang P Y, Zhang G M, et al. Enhancement of corn stover hydrolysis with rumen fluid pretreatment at different solid contents: Effect, structural changes and enzymes participation[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2017, 119: 405-412.

[22]Baba Y, Matskuti Y, Mori Y, et al. Pretreatment of lignocellulosic biomass by cattle rumen fluid for methane production: Bacterial flora and enzyme activity analysis[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2017, 123(4): 489-496.

[23]Chen L, Dong Z H, Li J F, et al. Ensiling characteristics, in vitro rumen fermentation and microbial communities and aerobic stability of low-dry matter silages produced with sweet sorghum and alfalfa mixtures[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2019, 99(5): 2140-2151.

[24]Xing L, Chen L J, Han L J, et al. The effect of an inoculant and enzymes on fermentation and nutritive value of sorghum straw silages[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(1): 488-491.

[25]He L W, Chen W, Wang C, et al. Improving fermentation, protein preservation and antioxidant activity of moringa oleifera leaves silage with gallic acid and tannin acid[J]. Bioresource Technology, 2020, 297: 122390.

[26]王旭輝，徐鑫，寶哲，等. 高通量測序分析新疆沼液中發酵微生物的多樣性[J]. 農業工程學報，2019，35(5)：219-225.

Wang Xuhui, Xu Xin, Bao Zhe, et al. Analysis of fermentation microbial diversity in biogas slurry by using high-throughput sequencing in Xinjiang, China[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(5): 219-225. (in English with Chinese abstract)

[27]朱見深，胡明，齊靜，等. 基于高通量測序分析青貯玉米微生物多樣性[J]. 山東農業科學，2020，52(4)：68-72.

Zhu Jianshen, Hu Ming, Qi Jing, et al. Analysis of microbial diversity of maize silage by high-throughput sequencing[J]. Shandong Agricultural Sciences, 2020, 52(4): 68-72. (in Chinese with English abstract)

[28]Liu B, Huan H, Gu H, et al. Dynamics of a microbial community during ensiling and upon aerobic exposure in lactic acid bacteria inoculation-treated and untreated barley silages[J]. Bioresource Technology, 2019, 273: 212-219.

[29]Zhao Y, Yu J, Liu J, et al. Material and microbial changes during corn stalk silage and their effects on methane fermentation[J]. Bioresource Technology, 2016, 222: 89-99.

[30]Gallagher D, Parker D, Allen D J, et al. Dynamic bacterial and fungal microbiomes during sweet sorghum ensiling impact bioethanol production[J]. Bioresource Technology, 2018, 264: 163-173.

[31]蘇良湖，陳梅，孫旭，等. 谷類秸稈接種瘤胃液的厭氧消化性能和三維熒光光譜特征[J]. 生態與農村環境學報，2018，34(11)：1034-1041.

Su Lianghu, Chen Mei, Sun Xu, et al. The anaerobic digestion performance of cereal straw inoculated with rumen fluid and its three-dimensional excitation emission matrix fluorescence spectroscopic characteristics[J]. Journal of Ecology and Rural Environment, 2018，34(11): 1034-1041. (in Chinese with English abstract)

[32]Zhao G Z, Kuang G, Wang Y, et al. Effect of steam explosion on physicochemical properties and fermentation characteristics of sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench)[J]. Food Science and Technology, 2020, 292: 121975.

[33]Botella C, Zhang K, Baugh A, et al. Reversible acid pretreatment scale up studies for the production of cellulosic ethanol from ensiled sweet sorghum[J]. Biochemical Engineering Journal, 2019, 150: 107266.

[34]孟堯，魏志謀，鄭明霞，等. 瘤胃液用于玉米秸稈產酸的影響因素[J]. 環境工程學報，2017，11(1)：497-502.

Meng Yao, Wei Zhimou, Zheng Mingxia, et al. Influencing factor of VFA production with corn straw inoculated with rumen fluid[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2017, 11(1): 497-502. (in Chinese with English abstract)

Effects of rumen fluid addition on the ensiling quality of whole-plant sweet sorghum

Ren Haiwei1,2,3, Lu Nana1, Lu Lirong1, Sun Wenli1, Wang Zhiye2, Li Jinping1,3,4, Li Zhizhong1※

(1./730050; 2.730000; 3.730050; 4.730050)

Sweet sorghum is a variety of promising energy crops with high sugar content, rapid growth rate, and strong resistance to saline-alkaline soils. Appropriate storage is highly required to utilize this feedstock for continuous bioenergy production, particularly harvested in a seasonal manner in China. In this study, the addition of rumen fluid was introduced to sweet sorghum for better ensiling quality during long-term (30 to 60 days) storage. A systematic investigation was made on the ensiling profile, including the organic components, fermentation quality, and enzymatic hydrolysis of sweet sorghum silage. Furthermore, an experimental analysis was performed on the dynamic process of microbial community during ensiling. The sweet sorghum was ensiled at 5 different dosages of rumen fluid: CK, silage without the addition of additive; R1, silage with rumen fluid at 1 mL/100 g, R3 at 3 mL/100 g, R5, 5 mL/100 g, R7 at 7 mL/100 g substrate. The results showed that the contents of dry matter (DM), water-soluble carbohydrates (WSC), crude protein (CP), and ammonia nitrogen (AN) decreased significantly, as both ensiling time and dosage increased in four treatments with the addition of rumen fluid, compared with the CK silages without rumen fluid. The increased rumen fluid and prolonged ensiling contributed to reducing the content of acid detergent fiber (ADF), neutral detergent fiber (NDF), cellulose, and hemicellulose, while elevating the abundance of beneficialin silages. Lignin in silages at ensiled for 60 days was effectively removed when the maximum dosage of rumen fluid was up to 7 g/100 g. There was a significant decrease in the contents of lactic acid and acetic acid, as well as the pH values in five treatments (CK, R1, R3, R5, R7), with the extension of the ensiling period (<0.05). The contents of lactic acid and acetic acid in R7 and R5 were higher than those of treatments after 60 days, which were 9.42 g/kg (R7) and 29.08 g/kg (R5), respectively. The dominant phylum in CK silages was stillafter ensiling, where the relative abundance was up to 96.1% and 81.2% after 30 and 60 days, respectively. However, the bacterial communities changed significantly, due to the fact the bioaugmentation of rumen fluid resulted in the coexistence ofandin bioaugmented silages. After bioaugmented ensiling for 30 days,andbecame enriched in the range of 18.2-46.2% and 3.61-18.0%, respectively, as the dosage of rumen fluid increased. After 60 days of ensiling, the relative abundance ofincreased from 45.2 (R1) to 81.1% (R7) with the increase of rumen fluid dosage. The addition of rumen fluid also enhanced the reducing sugar yield during enzymatic saccharification for 72 h. Specifically, the yields of reducing sugars in all treatments at 30 days significantly increased by 26% (CK), 30% (R1), 34% (R3), 40% (R5), and 44% (R7), respectively, compared with the raw sweet sorghum. The bioaugmented ensiling improved substantially the yield of reducing sugars, compared with the CK silages, indicating a positive correlation to the dosage of rumen fluid. It was also found that the 72 h reducing sugars yields of all silages at 60 days were significantly higher than those at 30 days. The R7 silage achieved the highest reducing sugars yield of 795.4 mg/g after 60 days of silage, indicating a linear correlation to the high biodegradation potential. The addition of rumen fluid can effectively improve the ensiling quality and biodegradability of ensiled sweet sorghum, thereby serving as biological pretreatment via bioaugmentation. This finding can provide the promising ethanol utilization of sweet sorghum.

sweet sorghum; ensiling quality; rumen fluid; microbial community; enzymatic saccharification

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.05.025

TS209

A

1002-6819(2021)-05-0216-08

任海偉，盧娜娜，路力榕，等. 瘤胃液對全株甜高粱青貯質量的影響[J]. 農業工程學報，2021，37(5)：216-223.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.05.025 http://www.tcsae.org

Ren Haiwei, Lu Nana, Lu Lirong, et al. Effects of rumen fluid addition on the ensiling quality of whole-plant sweet sorghum[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(5): 216-223. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.05.025 http://www.tcsae.org

2020-11-23

2021-02-15

國家自然科學基金項目（51666010）；中國博士后科學基金面上項目（2018M631217）；蘭州理工大學紅柳杰出青年人才支持計劃（JQ2020）和一流學科計劃（0807J1）

任海偉，博士，教授，研究方向為生物質資源轉化利用。Email：rhw52571119@163.com。中國農業工程學會高級會員（E041200735S）

李志忠，教授，研究方向為可再生能源與環境工程。Email：zzli@lut.cn

中國農業工程學會會員：李志忠（E042700009M）