CFSE標記神經祖細胞方法的建立與驗證

周佳鋒，馬孟杰，彭小忠,2*，舒鵬程*

(1.中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 生物化學與分子生物學系醫學分子生物學國家重點實驗室 醫學靈長類研究中心 神經科學中心，北京 100005；2.中國醫學科學院 醫學生物學研究所，云南 昆明 650118)

大腦皮質作為神經系統的最高級部分，在意識、運動調節等多方面發揮重要功能，而神經祖細胞(neural progenitor cells, NPCs)在大腦皮質的發育中起到至關重要的作用。發育早期神經祖細胞不對稱分裂產生神經元，而在晚期部分細胞能繼續產生膠質細胞[1]。因此研究神經祖細胞能夠加深人們對大腦皮質的了解。

特異的標記以及分選神經祖細胞是研究祖細胞必不可少的實驗。目前常用的標記方法包括5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine, BrdU)標記、病毒標記以及子宮內電轉(in utero electroporation)標記[2-6]。羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)可透膜，在胞內被水解為乙酸基團，水解后的CFSE無法透膜，結合胞內蛋白從而穩定標記細胞[7]。將CFSE注射到側腦室，所有與腦脊液直接接觸的細胞都將被標記，包括處于M期的神經祖細胞[8]。Denis Jabaudon等人開發的FlashTag技術就用到了上述的原理[7]。然而若要做到上述的特異標記神經祖細胞，必然要求染料能夠較好地局限在腦室區，而非向上擴散到皮質板區。本研究探索了CFSE標記神經祖細胞的方法并進行了體內、體外驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：本研究用到的所有小鼠均為SPF級CD-1孕鼠，購自北京大學醫學部，12周齡，懷孕天數為14.5 d，體質量在50 g左右。完成實驗后的小鼠通過頸椎脫臼法處死。本研究已通過北京協和醫學院基礎學院實驗動物中心的實驗動物倫理審查(倫理編號ACUC-A01-2021-009)。

1.1.2 主要試劑：CFSE(Thermo Fisher Scientific公司)，D-PBS(Gibco公司)。使用抗體如下：兔抗FITC(ab19224, 1∶500稀釋)、兔抗Tbr2(ab23345, 1∶500稀釋)、兔抗NeuroD2(ab104430, 1∶500稀釋)(Abcam公司)；兔抗Sox2(Sigma-Aldrich AB5603, 1∶500稀釋)、兔抗Cux1(sc13024, 1∶500釋)、鼠抗Tle4(sc365406, 1∶500稀釋)(Santa Cruz公司); 抗兔647熒光二抗(A-31573, 1∶1 000稀釋)、抗鼠647熒光二抗(A-31571, 1∶1 000稀釋)(Molecular Probes公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠子宮內注射:參考以往的鼠胚電轉實驗以及“FlashTag”方法[7,9]，將孕鼠麻醉后，小心分離出胎鼠，利用玻璃毛細管針，在E13.5和E14.5分別將混有快綠(Fast Green)的CFSE注射到側腦室，注射量為0.2 μL，隨后將胚胎放回腹腔，縫合。

1.2.2 免疫熒光實驗:收集的組織固定包埋于-80 ℃。組織冰凍切片厚度為16 μm。綿羊血清封閉后孵育一抗，4 ℃過夜。二抗用對應源的熒光二抗，稀釋比例為1∶1 000。

將流式分選得到的細胞鋪板，待細胞固定到爬片上后再進行免疫熒光步驟，操作與上述類似。

1.2.3 神經祖細胞分選:CFSE注射到側腦室后1 h，頸椎脫臼法處死孕鼠，收集胎鼠，用鑷子分離大腦皮質兩側半球的背側，隨后使用剪刀破碎組織，用accutase 酶于37 ℃消化30 min左右，期間每5 min用1 mL移液器吹打20次[10]，獲得的細胞懸液過篩成單細胞懸液，離心后用300 μL 0.5% BSA D-PBS(Dulbecco’s phosphate buffer saline)重懸。細胞懸液在上機前用200 μL移液器重懸，采用Sony SH800全自動流式分選儀，分選出熒光強度前10%的細胞[7]，記為強陽性細胞。

2 結果

2.1 CFSE能夠快速標記VZ區細胞

在CFSE被注射到側腦室后1、3和6 h時收取胚胎，檢測信號(圖1A)?？梢钥吹紺FSE信號均勻的分布在室周區ventricular zone (VZ)區域，包括背側和腹側，同時還延伸至第三腦室(圖1B)。注射后1 h，可以在VZ區觀察到較強的CFSE信號，同時，所有有絲分裂標志物(PH3)陽性的細胞均被CFSE標記(圖1C)。注射后3 h，CFSE依然能夠標記VZ區細胞，但是有少量PH3陽性細胞并未被標記(圖1C′，白色箭頭)。注射后6 h，CFSE信號在最低端區域已無法檢測到，同時被標記的細胞也已向上遷移離開該區域(圖1C″)。

A.A graphic diagram of the injection of CFSE and the detection strategy; B.an overall view of the distribution of CFSE at 1 hour post-injection; C-C″.co-labelling with mitotic marker PH3 at 1, 3 and 6 hours post-injection, respectively; scale bar=100 μm圖1 CFSE的分布高度局限于VZ區Fig 1 CFSE showed a highly restricted distribution within the VZ(n=3)

2.2 CFSE長時程標記具有一定的穩定性

在胚胎期第14.5天(embryonic day 14.5, E14.5)進行CFSE標記，出生后第1天(postnatal day1, P1)收取組織檢測(圖2A, A′,D,D′)，通過免疫熒光對大腦皮質神經元進行標記，顯示CFSE信號集中在Tle4的上方，即皮質上層區域(圖2C)。CFSE的信號強度存在較大的差異，部分細胞的信號非常微弱，用FITC抗體可以放大信號(圖2B,B′，白色箭頭)。到P3時，CFSE信號集中在上層，在Cux1陽性區域形成一個較薄的亞層(圖2F)。類似地，通過FITC抗體增強信號，可以發現有較多的細胞CFSE信號發生了衰減(圖2E,E′,白色箭頭)。

A-A′, D-D′.an overall view of the distribution of CFSE signal; B-B′, E-E′.detection with anti-FITC to enhance the signal; C, F.co-labelling with Tle4 and Cux1, respectively; scale bar=500 μm for A-A′ and D-D′;scale bar=200 μm for the rest圖2 CFSE信號在長時程標記中有衰減Fig 2 CFSE signal decayed in long-term labelling(n=3)

2.3 CFSE可用于分選神經祖細胞

CFSE注射1 h后收取腦組織，分離背側皮質，FACS分選熒光強度前10%的細胞(圖3A)，記為強陽性細胞。分選后的細胞通過Sox2、NeuroD2和Tbr2免疫熒光檢測以確定其身份(圖3B-B″, C-C″, D-D″)。統計發現Sox2陽性細胞占所有強陽性細胞的70%，Tbr2陽性細胞占13%，而NeuroD2陽性細胞占37%。

A.FACS sorting of top 10% positive cells; B-B″, C′-C″ and D-D″.co-labelling with Sox2, NeuroD2 and Tbr2 to identify sorted cells; E.a bar chart of the ratio of marker-positive cells to total FT-positive cells;S for Sox2, T for Tbr2, N for NeuroD2 and F for CFSE圖3 CFSE可用于分選神經祖細胞Fig 3 CFSE was suitable for sorting of neural progenitor cells (scale bar=100 μm, n=3)

3 討論

神經干細胞的在體標記和示蹤是揭示神經系統發育機制的重要手段，目前常用的標記方法有BrdU標記、電轉標記以及FlashTag等[2,7]。原理上，BrdU是一種核苷酸類似物，在S期DNA復制時摻入進而標記細胞。子宮內電轉通過電場作用將表達熒光蛋白的質粒轉入細胞內，主要標記S期和M期的細胞。FlashTag則是利用了某些脂溶性染料進入細胞后被分解為水溶性物質進而被鎖定在細胞內的特點，將染料注射到腦室后標記VZ區M期細胞。

上述標記原理決定了它們的檢測時間和標記時長上存在差異。BrdU可以快速摻入正在復制的DNA中。因此，在注射后30 min即可被檢測到。CFSE在注射后也可以快速進入細胞進行標記，據報道在注射后的20 min即可檢測到信號。而電轉的質粒表達蛋白需要10 h甚至更久[7]。在標記時長方面，三者也存在差異，通常認為BrdU的標記時長在2～6 h，6 h后體內的BrdU濃度已無法再標記細胞。以往的文獻報道CFSE的標記時長在2～3 h[7]，而本研究的結果與以往的報道有一定的差異。在本研究中，CFSE注射后3 h，VZ區依然有較多的CFSE殘留，能夠繼續標記細胞，而到注射后6 h，VZ區已幾乎沒有CFSE信號，因此推測CFSE的標記時長在3～6 h。與上述兩種方法相比，電轉質粒是依賴電場的瞬間標記，電場作用消失后也就無法再標記細胞。

CFSE標記神經祖細胞后可進一步被用于細胞分選。本實驗分選了CFSE熒光強度前10%的細胞。雖然這些強陽性細胞大部分是Sox2陽性的神經祖細胞，但部分卻是NeuroD2陽性的細胞，而NeuroD2僅表達于有絲分裂后的神經元(post-mitotic neurons)[11]。CFSE主要標記VZ區底端的細胞，但CFSE也有可能向上滲透標記遠端的細胞，同時部分遠端細胞的end-feet可能會吸收CFSE進而也被標記上[7]。另外，細胞被分選后還需在培養基中進行長達10 h的細胞爬片，期間部分細胞可能發生分化，表達NeuroD2。綜上，雖然目前的分選策略已可以保證一定的純度，但或許設置更嚴格的分選策略能進一步提高分選的純度。