分散微固相萃取/超高效液相色譜-高分辨質譜法測定茶葉中高氯酸鹽

韋 昱，方從容，趙云峰，陳達煒，李敬光

(國家食品安全風險評估中心/衛生部食品安全風險評估重點實驗室，北京 100021)

高氯酸鹽作為一類新型環境污染物普遍存在于環境和食品中，人類活動排放是其主要來源，如航天燃料、煙花爆竹，以及含氯消毒劑、化肥、除草劑的生產使用。高氯酸鹽對人體的危害主要是引起甲狀腺功能減退而導致一系列疾病[1-5]。環境中的高氯酸鹽以不同形式進入水和土壤后，可被茶樹吸收富集，導致茶葉中高氯酸鹽含量增加。近年來，中國超90%的茶葉檢出高氯酸鹽，平均含量為100～200 μg/kg，最高可達1 600 μg/kg[6]。目前，食品安全國家標準尚未對茶葉中高氯酸鹽的限量進行規定，但2020年5月歐盟委員會規定茶葉中高氯酸鹽的最大殘留量為750 μg/kg[7]。建立有效、簡便的茶葉中高氯酸鹽檢測方法對于安全飲茶至關重要。

茶葉中高氯酸鹽的檢測方法主要包括離子色譜法[8]、離子色譜-串聯質譜法(IC-MS/MS)[9-10]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[11-13]等。由于茶葉中高氯酸鹽的含量多為痕量級別，且考慮到儀器的普適性，LC-MS/MS成為一種較優選擇。茶葉富含茶多酚、生物堿、氨基酸等多種生物活性物質，在質譜檢測分析中易對高氯酸鹽產生基質效應影響，因此對樣品有效凈化是關鍵步驟[14-16]。目前，茶葉中高氯酸鹽的樣品前處理多采用分散固相萃取法(DSPE)和固相萃取法(SPE)。其中，DSPE法是應用固體吸附劑吸附茶葉提取液中的干擾物質，如石墨化碳黑(GCB)被應用于茶葉樣品前處理以檢測高氯酸鹽[17]，但該方法凈化效果不佳；吸附型SPE法是應用固體吸附劑吸附茶葉中的高氯酸鹽進而獲取較優的凈化效果，然而尋找一種合適的有效吸附劑存在困難，十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、TPT、親水親脂平衡聚合物(HLB)等類型的SPE柱對純化水、牛奶、水果、蔬菜等樣品中的高氯酸鹽提取效果良好，但不適用于基質復雜的茶葉樣品[18]。因此，文獻報道多采用通過型SPE法，即通過固體吸附劑完成對干擾物的吸附，這在一定程度上降低了凈化效果。此外，SPE法的成本較高，需要淋洗、平衡和濃縮等程序，操作不夠簡便。

分散微固相萃取(DMSPE)是基于DSPE和SPE技術，將固體吸附劑分散于提取液中吸附目標分析物，進而再洗脫的原理，提高了復雜基質樣品的凈化效果[19-20]。Zhang等[19]采用DMSPE技術，將混合吸附劑(強陽離子交換吸附劑PCX和強陰離子交換吸附劑PAX)成功應用于海水中脂溶性海洋毒素的富集和凈化。該技術操作簡便，各吸附劑之間可混合使用，是優化茶葉樣品前處理的潛在方法之一，但其應用鮮有報道?；诓枞~中高氯酸鹽檢測的現狀與難點，本研究采用DMSPE技術對茶葉樣品進行前處理，優化了吸附劑及前處理條件，并結合超高效液相色譜-高分辨質譜(UHPLC-HRMS)技術，建立了茶葉中高氯酸鹽的測定方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-高分辨質譜儀(U3000/Q Exactive，美國Thermo-Fisher公司)；渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)，高速離心機(美國Sigma公司)。

高氯酸鹽標準溶液(1 000 mg/L，上海Sigma公司)，18O4-高氯酸鹽同位素內標溶液(200 mg/L，加拿大TRC公司)；質譜級乙腈和甲醇(美國Fisher Scientific 公司)，HPLC級甲酸、乙酸和氨水(美國Tedia公司和上海安譜公司)；實驗用水由純水儀(美國Millipore公司)制備。陰離子交換吸附劑乙二胺基-N-丙基(PSA，平均粒徑40～60 μm，比表面積480 m2/g)、PAX(平均粒徑40～60 μm，比表面積600 m2/g)、PWAX(平均粒徑40～60 μm，比表面積600 m2/g)、SAX(平均粒徑50 μm，比表面積550 m2/g)、NH2(平均粒徑40～60 μm,比表面積550 m2/g)以及陽離子交換吸附劑PCX(平均粒徑30 μm,比表面積600 m2/g)、SCX(平均粒徑50 μm，比表面積600 m2/g)購自天津博納艾杰爾科技有限公司；GCB(美國Agilent公司)。5種微孔濾膜(混合纖維素膜、尼龍膜、聚四氟乙烯膜、聚醚砜膜和聚酯膜)購自上海Sigma和安譜公司。本研究于2017年至2018年間，從中國福建、安徽、云南、湖北和浙江省的當地超市收集了86份茶葉樣品，經粉碎均質成粉末并密封，于-20 ℃下儲存。

1.2 標準溶液的配制

準確移取適量高氯酸鹽標準溶液(1 000 mg/L)，用乙腈稀釋配制高氯酸鹽標準中間溶液(10、1 mg/L)。準確移取適量18O4-高氯酸鹽同位素內標溶液(200 mg/L)，用乙腈稀釋配制18O4-高氯酸鹽同位素內標中間溶液(1 mg/L)。吸取適量標準中間溶液和內標中間溶液，用乙腈稀釋成質量濃度為0.05～50 μg/L標準工作溶液，內標質量濃度為2 μg/L。

1.3 樣品前處理

準確稱取1.0 g茶葉樣品于15 mL離心管中，加入40 μL內標中間溶液(1 mg/L)靜置30 min。加入3 mL水，渦旋混合30 s，加入7 mL乙腈混勻后，超聲提取20 min。以8 000 r/min離心5 min后，移取1.0 mL上清液于裝有吸附填料(50 mg PSA和50 mg PCX)的2 mL離心管中，渦旋混勻30 s，使高氯酸鹽吸附于填料上，棄去上清液，而后用2.0 mL 5%氨水溶液進行洗脫，并將洗脫液以13 000 r/min離心5 min后，待分析。

1.4 儀器分析條件

本研究儀器分析條件的優化參見前期工作[11]，獲取的最優儀器參數條件如下：

色譜條件：Poroshell 120 PFP色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.9 μm)，柱溫：40 ℃，流速：0.6 mL/min，流動相A為甲醇，流動相B為1.0%乙酸水溶液。梯度洗脫程序：0～0.8 min，10% A；0.8～2.2 min，10%～100% A；2.2～2.5 min，100% A；2.5～4.0 min，100%～10% A。進樣量：5 μL。

質譜參數：采用加熱電噴霧離子化方式(HESI)；噴霧電壓為2 800 V；毛細管溫度為325 ℃；加熱溫度為400 ℃；鞘氣壓力為45 arb(465.3 kPa)，輔助氣壓力為10 arb(104.3 kPa)；負離子采集模式，靶向單一離子監測(TSIM)/數據依賴質譜(ddMS2)掃描模式；TSIM采集分辨率為70 000 FWHM，自動增益控制為2e5，最大注射時間為100 ms，分離寬度為5 Da；ddMS2采集分辨率為17 500 FWHM，Loop Count為1，TopN為2，碰撞裂解能量為150%。高氯酸鹽的定量離子為m/z98.948 5，定性離子為m/z82.953 4和84.950 4；18O4-高氯酸鹽同位素內標的定量離子為m/z106.968 0。

2 結果與討論

2.1 DMSPE吸附劑的優化

DMSPE技術結合了SPE和DSPE技術的優勢，但仍基于固液吸附原理，因此選擇合適的吸附劑是DMSPE技術的研究重點。GCB常被用作SPE和DSPE吸附劑對高氯酸鹽進行凈化，但由于其對不同復雜基質中高氯酸鹽及18O4-高氯酸鹽內標物質的吸附存在一定差異，從而影響檢測的準確度[21]。本研究考察了GCB對茶葉提取液中高氯酸鹽及18O4-高氯酸鹽內標物質的吸附行為，結果顯示GCB對加標茶葉提取液中高氯酸鹽及18O4-高氯酸鹽內標物質的吸附率分別為45%(圖1A)和56%，說明GCB不適合作為茶葉中高氯酸鹽的DMSPE吸附劑。

高氯酸鹽是一種陰離子化合物，帶陽離子基團的吸附劑對其具有較好的吸附效果，因而，本研究分別考察了50 mg的PSA、PAX、PWAX、SAX和NH2作為離子交換吸附劑對加標茶葉提取液中高氯酸鹽(100 μg/L)的吸附效果(見圖1A)。結果顯示，PSA對高氯酸鹽的吸附效果較差，吸附率僅為38%，而其它4種吸附劑由于具有相對較高的比表面積，對高氯酸鹽的吸附效果較優(85%～96%)。進一步考察了PSA對無基質的純溶劑高氯酸鹽標準溶液的吸附效果，發現高氯酸鹽的吸附效果有所提高(62%)，這說明PSA更易吸附茶葉中的干擾物，使得吸附位點被占據而導致對茶葉基質中高氯酸鹽的吸附效果較差。

圖1 不同吸附劑對茶葉提取液中高氯酸鹽(100 μg/L)的吸附率(A)與解吸附率(B)(n=3)Fig.1 Adsorption rate(A) and desorption rate(B) of different adsorbents on perchlorate in tea extract(100 μg/L)(n=3)

本研究選擇2.0 mL的5%甲酸水溶液和5%氨水溶液分別對已吸附高氯酸鹽的PSA、PAX、PWAX、SAX和NH2吸附劑進行洗脫，結果表明，2種洗脫劑均無法將目標分析物從PAX、PWAX、SAX和NH2吸附劑上較好的洗脫，解吸附率均低于50%(圖1B)?；谏鲜鲅芯拷Y果，單獨使用這5種吸附劑均無法獲取較佳的吸附或解吸附效果。值得注意的是，PSA與其它4種吸附劑有所不同，雖對高氯酸鹽的吸附效果不佳，但所吸附的高氯酸鹽可得到較好洗脫(98%)。

本研究嘗試將PSA與其它類型吸附劑聯用，以更好地獲得高氯酸鹽的吸附和解吸附效果。首先，將PSA與其它4種相同類型的陰離子交換吸附劑(PAX、SAX、PWAX和NH2)聯用，結果發現這些聯合吸附劑同樣對高氯酸鹽具有較好的吸附效果，但無法獲取較佳的解吸附效果。其次，選擇2種陽離子交換吸附劑(PCX和SCX)與PSA聯用，并采用基質匹配標準溶液對其進行考察。結果發現，單獨使用PCX或SCX對高氯酸鹽幾乎無吸附作用，但與PSA聯用后，均能改善單獨使用PSA對高氯酸鹽的吸附效果，吸附率升至90%，說明PCX或SCX的作用可能是通過吸附茶葉中的干擾物，從而釋放更多的PSA吸附位點，進而提高吸附率。在解吸附率考察中，采用2 mL的5% 氨水溶液洗脫能使高氯酸鹽在PSA和PCX聯合吸附劑上的解吸附率達到95%。然而，SCX與PSA聯用的解吸附率相較于PCX有所下降(87%)，分析其原因可能是PCX具有更細的平均粒徑，對于茶葉中干擾物的吸附較SCX更佳，從而獲取的基質效應更低。綜上，本研究以PSA與PCX聯用作為DMSPE吸附劑。

2.2 DMSPE條件的選擇

本研究考察了聯用吸附劑PSA和PCX的不同質量比(1∶0.5、1∶1和1∶2)對基質溶液中高氯酸鹽吸附和解吸附效果的影響。結果發現，在這3種質量比例下，高氯酸鹽均能獲取較佳的吸附效果，但比例為1∶1和1∶2的解吸附效果(>93%)均優于1∶0.5(82%)的解吸附效果。因此，考慮到價格成本和解吸附效果，確定選擇PSA和PCX的質量比為1∶1。

此外，通過對茶葉提取液中100 μg/L高氯酸鹽的分析，優化了吸附劑用量、洗脫溶劑體積和氨水比例(見圖2)。圖2A結果顯示，高氯酸鹽的提取回收率隨著吸附劑用量的增加而逐漸提高，當用量≥50 mg時，提取回收率達到88%以上并趨于平衡。圖2B結果顯示，2.0 mL的5%氨水溶液足以將吸附劑上的目標分析物洗脫完全。圖2C結果表明，隨著洗脫液中氨水的比例逐步提高，高氯酸鹽的提取回收率有所提高，5%的氨水溶液即可獲取最佳的洗脫效果。因此，本研究最終選擇50 mg PCX和50 mg PSA為混合吸附劑，以2.0 mL的5%氨水溶液進行解吸附。

圖2 不同DMSPE條件下高氯酸鹽的回收率(n=3)Fig.2 Recoveries of perchlorate at different DMSPE conditions(n=3)A：amount of adsorbent;B：volume of eluent;C：proportion of ammonium hydroxide

2.3 基質效應

茶葉樣品中的復雜基質可能增強或抑制高氯酸鹽的離子強度，進而影響定量分析的準確性。將空白茶葉樣品按“1.3”方法進行前處理，制得茶葉空白基質溶液。分別用5% 氨水溶液和茶葉空白基質溶液配制質量濃度為0.05～50 μg/L的系列標準工作溶液，作為純溶劑標準溶液和基質匹配標準溶液，并采用本方法進行分析。依據基質匹配標準曲線與純溶劑標準曲線斜率的比值評價基質效應，即斜率比值接近1.0時，表明基質效應較弱，斜率比值在0.8～1.2之間為可接受的基質效應。上述標準曲線的斜率比值為0.93，說明該方法的基質效應可忽略不計。因此，本研究采用純溶劑標準曲線完成對茶葉中高氯酸鹽的分析。

2.4 方法選擇性

本研究通過分析不同空白樣品中測定目標物的特異性(n=6)來考察方法選擇性。圖3顯示，高氯酸鹽的保留時間附近未發現基質干擾峰，說明本方法具有較好的選擇性。值得注意的是，在質譜儀器檢測前，往往需用微孔濾膜去除樣品分析液中可能存在的細小微粒，以避免色譜柱堵塞?？紤]到高氯酸鹽作為普遍存在的環境污染物，可能通過污染的微孔濾膜進而引入樣品分析液中，導致對樣品中高氯酸鹽含量的假陽性檢測或高估結果。為此，比較了5種不同品牌或類型的微孔濾膜(混合纖維素膜、尼龍膜、聚四氟乙烯膜、聚醚砜膜和聚酯膜)，分別用1 mL的5%氨水溶液洗脫。結果發現有3份分析液(混合纖維素膜、尼龍膜和聚酯膜)中分別檢出質量濃度為2.7、8.3、14.1 μg/L的高氯酸鹽。因此，樣品分析液不采用微孔濾膜過濾，而是采用13 000 r/min高速離心5 min，以避免高氯酸鹽或其它離子的背景干擾。

圖3 高氯酸鹽的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of perchlorateA：blank tea extract;B：1.0 μg/L of matrix-matched standard solution;C：spiked extract at LOQ level

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

配制質量濃度為0.05～50 μg/L的高氯酸鹽系列標準溶液，內標法定量，內標18O4-高氯酸鹽的質量濃度為2 μg/L。采用本方法進行分析，以系列標準溶液的質量濃度為橫坐標，高氯酸鹽與其同位素內標的提取離子色譜峰峰面積比值為縱坐標，繪制標準曲線。結果顯示高氯酸鹽在0.05～50 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數(r2)為0.999 7。

對茶葉空白基質溶液進行低水平加標實驗，分別以3倍和10倍信噪比(S/N)對應的加標水平為檢出限(LOD)與定量下限(LOQ)。高氯酸鹽在茶葉中的LOD為0.4 μg/kg，LOQ為1.2 μg/kg，遠低于歐盟對茶葉中高氯酸鹽750 μg/kg的限量值，該方法可滿足茶葉中高氯酸鹽的檢測要求，適用于茶葉中痕量高氯酸鹽的風險評估。

2.6 準確度與精密度

本研究選擇空白茶葉進行加標回收實驗，以考察方法的準確度和精密度。選定加標水平分別為1.2、12、120 μg/kg，按照“1.3”和“1.4”方法處理后上機測定，每個加標水平每日平行測定6次，連續測定3日。結果顯示，高氯酸鹽在3個加標水平下的回收率為87.4%～105%，日內相對標準偏差(RSDr)為0.30%～6.1%，日間相對標準偏差(RSDR)為4.2%～9.2%(見表1)，說明本方法的準確度和精密度良好。

表1 茶葉中高氯酸鹽的回收率與相對標準偏差Table 1 Recoveries and relative standard deviations for perchlorate in tea

2.7 方法比較

目前，茶葉中高氯酸鹽的檢測主要采用IC-MS/MS和LC-MS/MS法。與已報道的分析方法相比，如鄧家軍等[6]所綜述的茶葉中高氯酸鹽的方法LOQ在2～3 000 μg/kg之間，Liu等[18]報道的方法LOQ為10 μg/kg，Wang等[17]報道的方法LOQ為5 μg/kg，本研究所建立的方法具有更低的LOQ(1.2 μg/kg)。盡管Zhao等[12]報道的方法具有更低的LOQ(8.21 ng/kg)，但樣品前處理使用的QA-Mag-CCNTs吸附劑需要自制。本研究所用的吸附劑均已商品化，較易獲取。此外，本研究采用DMSPE凈化技術，可較大程度去除茶葉中的復雜干擾物，獲得更低的基質效應。同時，由于DMSPE技術是采用分散式吸附型凈化，吸附填料可自行組合，相較于商業化的SPE柱，操作更簡捷，且成本更低[21]。

2.8 實際樣品的測定

采用已建立的方法對86份茶葉樣品進行檢測，結果見表2。茶葉中高氯酸鹽的檢出率為91.9%，檢出含量為3.8～1 073 μg/kg，平均含量為163 μg/kg。此外，在一些茶葉樣品中檢測到高含量的高氯酸鹽，根據歐盟規定的限量值(750 μg/kg)，8份茶葉樣品中高氯酸鹽超過限量，檢測含量為841～1 073 μg/kg。

表2 茶葉樣品中高氯酸鹽的檢測結果數據分析(n=86，μg/kg)Table 2 Data statistics of perchlorate in real samples(n=86,μg/kg)

3 結 論

本文以PSA和PCX作為聯合吸附劑開展分散微固相萃取技術研究，結合超高效液相色譜-高分辨質譜，建立了茶葉中高氯酸鹽的檢測方法。該方法基質效應較小，凈化效果好，前處理操作簡單、成本低，靈敏度高，準確度和精密度均可滿足茶葉中高氯酸鹽的檢測要求，為我國茶葉的監測和風險評估提供了可靠的技術手段。