青藏高原低溫纖維素降解菌的篩選與酶學特性

■曹 慧 任世威 張騰月，2 秦亞寧，3 張 蘭，4 楊佳萌 張朋振

（1.河南科技大學動物科技學院，河南洛陽471000；2.廣東海洋大學農學院，廣東湛江524088；3.四川農業大學動物營養研究所，四川成都611130；4.西南民族大學畜牧獸醫學院，四川成都610041)

植物中的結構性多糖主要是纖維素與半纖維素[1]，能將兩者降解為可溶性糖的酶被稱為纖維素酶和半纖維素酶[2]。纖維素酶在飼料、紡織、食品加工中均有廣泛應用[3-4]。纖維素降解過程中，半纖維素酶對纖維素酶的水解效率有促進作用[5]。反芻動物飼料中含有大量的纖維素與半纖維素，但動物消化道自身不產生纖維素酶，無法直接高效利用纖維素[6]。我國早在20 世紀90 年代便開始了對飼用酶制劑的研究與應用[7]。微生物發酵產生的纖維素酶與半纖維素酶廣泛應用在反芻動物飼用酶制劑中。商業酶制劑的最適作用溫度普遍為60 ℃[2]，與反芻動物瘤胃的溫度（39 ℃）[8]差別較大，影響纖維素酶的水解效率。因此，篩選適應低溫環境的纖維素降解菌成為近年的研究熱點。

青藏高原平均海拔4 000 m 以上，具有海拔高、輻射強、低溫、低氧等特點，其獨特的自然氣候和地域特征，使得土壤微生物對青藏高原特殊生態環境產生了特有的生理適應機制[9-10]。權淑靜等[11]從青藏高原土壤樣品中篩選出低溫條件下產蛋白酶的菌株LS20-2，被鑒定為皮氏類芽孢桿菌。謝占玲等[12]從青海湖中分離到617株耐鹽真菌，首次系統研究了青海湖中耐鹽真菌的多樣性，展示了青海湖中豐富的耐鹽真菌資源。本研究旨在通過對青藏高原土壤微生物中低溫纖維素降解菌株的篩選與酶學特性研究，以期尋找新的纖維素酶資源，為高原菌種資源利用提供科學依據，為我國飼用酶制劑的研發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

用梅花形采樣法，從青藏高原冷地早熟禾草地采集土壤樣品，-20 ℃保存備用。

1.1.2 主要培養基

篩選培養基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）5 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、NaNO33 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂17 g、純化水1 L，pH值5.5～6.0。

純化培養基：200 g 土豆浸出液、葡萄糖20 g、KH2PO40.02 g、MgSO4·7H2O 0.015 g、瓊脂20 g、純化水1 L，pH值5.5～6.0。

發酵培養基：CMC-Na 5 g、蛋白胨3 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、NaNO33 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.5 g、純化水1 L，pH值5.5～6.0。

上述培養基均需121 ℃高壓滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑

CMC-Na（國藥集團化學試劑有限公司）、木聚糖（自提玉米芯木聚糖，提取方法參考趙龍妹等[13]）、DNS（3，5-二硝基水楊酸，配置方法參考王明瑞等[14]）、Triton X-100基因組提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]、葡萄糖、MgSO4·7H2O（江蘇強盛化工有限公司）、K2HPO4、KH2PO4（天津市凱通化學試劑有限公司）、瓊脂粉（天津市大茂化學試劑廠）。

1.1.4 儀器與設備

酶標儀（Bio-Rad laboratories Inc）、高壓滅菌鍋、氣浴恒溫振蕩器（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）、電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）、高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）、恒溫水浴鍋（上?？畦巸x器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選

初篩：10 g 土壤樣品、90 mL 無菌水于錐形瓶中，20 ℃、200 r/min 混勻30 min，取10-2土壤稀釋液200 μL均勻涂布于篩選培養基上，20 ℃培養72 h，選取單菌落純化培養。純化后的菌株點接種于篩選培養基，20 ℃培養72 h，用剛果紅染色法[15]觀察菌落透明圈，測量菌落直徑（d）及透明圈直徑（D），選擇D/d值較大的菌株為初篩菌株。

復篩：初篩菌株接種于發酵培養基，20 ℃、200 r/min振蕩培養72 h，發酵液12 000 r/min 離心10 min 制備粗酶液，進行纖維素酶活力測定，選取酶活力最大的菌株為目標菌株，并測定半纖維素酶活力。

1.2.2 纖維素酶活力的測定

0.25 mL粗酶液與0.25 mL底物（1%羧甲基纖維素鈉溶液）混勻，40 ℃水浴反應30 min，立即加入0.75 mL DNS 終止反應，沸水浴顯色10 min，冷卻至室溫，在540 nm波長下測定吸光度。

酶活力定義：在40 ℃，pH 值6 時，每分鐘水解底物（1%羧甲基纖維素鈉溶液）產生1 μg還原糖對應的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.2.3 半纖維素酶活力的測定

0.3 mL 粗酶液與0.45 mL 底物（1%木聚糖溶液）混勻，50 ℃水浴反應30 min，立即加入0.75 mL DNS終止反應，沸水浴顯色10 min，冷卻至室溫，在540 nm波長下測定吸光度。

酶活力定義：在50 ℃，pH 值6 時，每分鐘水解底物（1%木聚糖溶液）產生1 μg木糖對應的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.2.4 菌株鑒定

形態學鑒定：菌株于純化培養基培養后，觀察菌落與菌體形態，并進行革蘭氏染色鏡檢觀察。分子生物學鑒定：用Triton X-100 基因組提取試劑盒提取菌株的基因組DNA。參照孫佑赫等[16]的方法，用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）擴 增 菌 株16S rRNA基因序列，經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果在NCBI中進行比對。應用形態學特征和分子生物學方法[16]對目標菌株進行菌種鑒定。

1.3 酶學性質初步研究

菌株發酵液離心制備粗酶液，進行相對酶活力測定。不同溫度（20、30、40、50、60 ℃）下測定纖維素酶和半纖維素酶的相對酶活力確定最適反應溫度。不同pH值條件（4、5、6、7、8、9、10）測定纖維素酶和半纖維素酶的相對酶活力確定最適pH 值。測定酶的溫度穩定性，在不同溫度（30、40、50、60、70 ℃）下保溫30 min 后測定纖維素酶和半纖維素酶相對酶活力。測定酶的pH 值穩定性，在不同pH 值（4、5、6、7、8、9、10）下保溫1 h 后測定纖維素酶和半纖維素酶相對酶活力。測定濃度為10 mmol/L 的不同金屬離子（Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+）對纖維素酶和半纖維素酶相對酶活力的影響。

1.4 產酶曲線的測定

將該菌株接種于發酵培養基，20 ℃、200 r/min振蕩培養120 h，每6 h取1次，測定酶活力。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

通過菌落透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值（見圖1）和酶活力大小的比較，篩選出一株低溫纖維素降解菌LD19，該菌株還具有產半纖維素酶的能力。

2.2 菌株的鑒定

形態鑒定：該菌株為白色不規則圓形菌落，不透明，中央微凸，難挑?。ㄒ妶D2）。菌絲彎曲較細，呈絲狀（見圖3），初步鑒定為放線菌。

圖1 菌株LD19菌落透明圈

圖2 菌株LD19菌落形態

圖3 菌株LD19菌絲形態

分子鑒定：該菌株與已知菌株Streptomyces clavifer的16S rDNA序列相似度為99%，確定菌株LD19為釘斑鏈霉菌（Streptomyces clavifer）。

2.3 酶學性質初步研究

2.3.1 酶的最適反應溫度（見圖4）

不同溫度下測定纖維素酶相對酶活力與半纖維素酶相對酶活力，以最大相對酶活力值為100%。由圖4 可知，纖維素酶最適反應溫度為40 ℃，屬低溫纖維素酶，20～40 ℃時相對酶活力不斷增大，40 ℃后相對酶活力逐漸降低；半纖維素酶最適反應溫度為50 ℃，20～50 ℃時相對酶活力不斷增大，50 ℃后相對酶活力迅速降低。

圖4 酶的最適反應溫度

2.3.2 酶的溫度穩定性（見圖5）

圖5 酶的溫度穩定性

由圖5 可知，在40 ℃保溫處理30 min 纖維素酶和半纖維素酶相對酶活力均達到最高。纖維素酶在30～70 ℃時仍能保持較高相對酶活力，半纖維素酶在50～70 ℃時相對酶活力僅在40%左右。

2.3.3 酶的最適反應pH值（見圖6）

由圖6 可知，該纖維素酶與半纖維素酶在pH 值為6時酶活力均達到最高，最適反應pH值均為6。纖維素酶在pH 值4～10 時能保持75%以上的相對酶活力，說明該纖維素酶pH 值適應范圍較廣。半纖維素酶在pH 值4～8 是相對酶活力維持在80%左右，pH 值大于8后相對酶活力迅速下降，說明該半纖維素酶適用于弱酸性和中性環境。

圖6 酶的最適反應pH值

圖7 酶的pH值穩定性

2.3.4 酶的pH值穩定性（見圖7）由圖7可知，該纖維素酶在pH值4～10處理1 h后仍能保持90%以上的相對酶活力，該半纖維素酶在pH值9時仍有60%以上相對酶活力，說明這兩種酶在酸性和堿性環境下均有良好的耐受性。

2.3.5 不同金屬離子對相對酶活力的影響（見圖8）

圖8 金屬離子對酶的相對酶活力的影響

圖8可知，不同金屬離子對纖維素酶和半纖維素酶相對酶活力的影響存在明顯差異，以不添加金屬離子時的相對酶活力為100%。除Zn2+對纖維素酶相對酶活力具有抑制作用外，Ca2+、Mn2+、Cu2+等對纖維素酶相對酶活力都具有激活作用。Cu2+對半纖維素酶相對酶活力的激活作用最大，Na+、K+等對半纖維素酶相對酶活力具有抑制作用。

2.4 產酶曲線的測定（見圖9）

圖9 菌株LD19產酶曲線

由圖9 可知，菌株LD19 所產纖維素酶與半纖維素酶活力在0～96 h 均呈增長趨勢，102 h 時纖維素酶活力為21.6 U/mL，半纖維素酶活力為16.8 U/mL，同時達到酶活力最大值，之后酶活力開始下降。

3 討論

纖維素是自然界中最豐富的碳水化合物[17]，但其中89%左右的纖維素資源未能開發利用，不僅造成大量的資源浪費，還造成了環境污染問題[6]。微生物產酶降解纖維素具有反應條件溫和、環保、高效、無污染等優點[18]，在自然界和工業生產中，纖維素的降解幾乎都是通過生物降解法完成的[19]。自然界中能產生纖維素酶的微生物主要有真菌、細菌和放線菌。真菌對纖維素的降解能力比較突出，具有分泌酶系全面、酶量大、酶活力高等優點，已被應用于酶制劑生產[20]。細菌產纖維素酶具有培養簡單、發酵周期短、生長速度快、耐高溫等優點，許多高產纖維素酶的細菌從不同的環境分離出來并被廣泛研究應用[21]。相較于真菌和細菌，放線菌生長周期較長、產量較低，所以目前對放線菌的研究相對較少。有研究表明，放線菌的耐熱性和對極端環境的適應能力較強[22]。

本研究中篩選出的菌株LD19經鑒定為釘斑鏈霉菌（Streptomyces clavifer），能同時產纖維素酶和半纖維素酶。Meij 等[23]從野生擬南芥的根部分離出優勢內生菌Streptomyces clavifer，該菌特殊的定植方式使其在根部組織中具有競爭優勢。Balakrishnan 等[24]從印度尼西亞野生動物保護區土壤樣品中分離出的菌株Streptomyces clavifer TBG-MNR13（MTCC4150）有較強的產纖維素酶能力。鏈霉菌是自然界中最豐富的放線菌，能產生多種纖維素酶與半纖維素酶[24-25]，二者在木質纖維素降解過程中起協同作用，將纖維素降解為葡萄糖，將半纖維素降解為低聚木糖、木糖和阿拉伯糖等降解產物[26]，應用于畜牧行業能降低食糜黏度、減少飼料內源損失、改善腸道內的菌群結構，從而改善畜禽生產性能，提高養分和能量的利用效率[27]。孫曉萌等[22]通過對降解木質纖維素放線菌的功能組學分析證實了放線菌對木質纖維素的降解能力及其巨大的工業應用前景。楊彬等[28]從荔枝腐葉中篩選出一株具有木質纖維素降解能力的綠木霉（Trichoderma virens），能同步分泌高效纖維素酶和木聚糖酶，具有應用于木聚糖酶和木寡糖生產的潛力。李鵬飛等[6]從綿羊糞便中分離篩選出一株能夠產生高活力纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的目的菌B5，經鑒定B5菌株為鏈霉菌屬（Streptomyces sp.），對飼料粗纖維降解效率與酶活力顯著相關。李師翁等[29]從青藏高原采集的牦牛糞中分離得到一株產低溫纖維素酶能力較強的放線菌，初步鑒定為鏈霉菌屬。

菌株LD19不僅能同時產生纖維素酶和半纖維素酶，而且所產纖維素酶的最適反應溫度與pH 值和反芻動物瘤胃條件相似，酶的溫度穩定性與pH 值穩定性較好，增加了該菌在實際生產中的應用性。研究發現[30-32]，將纖維素酶與半纖維素酶結合應用到反芻動物飼糧中，可以提高飼料利用效率，改善動物生產性能，所以該菌株在飼用酶制劑中有較大的應用潛力。但是將該菌株所產纖維素酶與半纖維素酶作為飼用酶制劑應用于反芻動物的實際生產中還須做很多工作，飼用酶制劑的添加方式、添加量、添加時間等都有待進一步的研究。

4 結論

本研究從青藏高原冷地早熟禾田土壤中篩選出一株低溫纖維素酶降解菌LD19，該菌株具有產纖維素酶和半纖維素酶的能力。通過形態學與分子生物學鑒定確定LD19 為釘斑鏈霉菌（Streptomyces clavifer）。菌株LD19在20 ℃、200 r/min振蕩培養102 h時纖維素酶與半纖維素酶活力均達到最高值，纖維素酶活力為21.6 U/mL，半纖維素酶活力為16.8 U/mL。進行酶學性質初步研究，結果表明：該纖維素酶最適反應溫度為40 ℃，屬低溫纖維素酶，最適pH 值為6，在30～70 ℃、pH值4～10時纖維素酶相對酶活力較穩定，Mn2+、Ca2+、Cu2+等對該纖維素酶有激活作用，Zn2+對該酶有抑制作用；該半纖維素酶最適反應溫度為50 ℃，最適pH值為6，30～40 ℃處理30 min后剩余相對酶活力在40%左右，pH 值4～9 時相對酶活力穩定，Cu2+、Mn2+、Fe3+對該半纖維素酶有促進作用，Zn2+對該酶的抑制作用最大。