miR-33b靶向HMGA2 基因表達抑制食管癌細胞遷移的實驗研究

薛萌，刁云輝，樊宏偉

（南陽市中心醫院消化內科一病區，河南 南陽 473009）

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，病灶內癌細胞的遷移能力極強，容易在早期出現腫瘤病灶的浸潤，單純手術切除后的生存率較低[1,2]。食管癌的發生涉及多基因、多環節、多因素且未完全闡明。小 RNA （microRNA，miR） 是一類長度 18-22nt 并在轉錄后水平調控基因表達的一類非編碼RNA，與靶基因 mRNA 的 3’非編碼區（3’-untranslated region，3’UTR）結合后阻礙 mRNA 的翻譯，最終實現對靶基因表達的抑制。在惡性腫瘤組織中，多種miRs 的表達存在異常，靶向原癌基因的miRs下調或靶向抑癌基因的miRs 上調均起到促癌作用[3-5]。miR-33b 是一類具有抑癌作用的miR，已經在胃癌、 黑色素瘤等惡性腫瘤細胞中被證實能夠靶向高遷移率族蛋白A2 （high mobility group A2，HMGA2）基因并抑制細胞遷移[6,7]。但miR-33b 在食管癌發生發展中的具體作用機制及HMGA2 是否受到miR-33b 的靶向調控尚不完全清楚。為此，本研究具體分析了miR-33b 靶向HMGA2 基因表達抑制食管癌細胞遷移的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 食管癌Eca9706 細胞系購自中科院上海生命科學院細胞資源中心，DMEM 培養基、胎牛血清（FBS）購自 Gibco 公司，陰性對照（NC）模擬物(序列：5’-GUUAUCAGUGACUAGCGUA-3’)、miR-33b 模擬物（序列：5’-GCUAGCAUGCUGAUGUCA-3’）、NC-siRNA（序列：5’-UGCAUGUACGC UAGCUAU-3’）、HMGA2-siRNA （序列：5’-UAGC UAGGCUAGCUAGUG-3’）、pcDNA3.0 空白質粒、pcDNA3.0-HMGA2 質粒均購自上海吉瑪公司，雙熒光素酶報告基因（Psi-check2 質粒）及檢測系統均購自Promega 公司，Lipofectamine2000 試劑購自Invitrogen 公司，Transwell 小室購自 Corning 公司，DIO 細胞膜綠色熒光染液購自上海碧云天公司，miRNA 提取試劑盒、miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒、 培養細胞/細菌總RNA 提取試劑盒、石蠟包埋組織切片總RNA 提取試劑盒、FastKing 一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑購自北京天能公司，HMGA2單克隆抗體購自Abcam 公司。顯微鏡購自Nikon公司，熒光定量 PCR 儀購自 ABI 公司，GloMax 2020 單管型發光檢測儀為北京原平皓生物技術有限公司

1.2 細胞培養和分組 Eca9706 細胞用含有10%FBS 的DMEM 貼壁培養，隔天進行胰蛋白酶消化并按1:3 傳代。得到足夠數量的細胞后接種在培養板內并進行分組、處理。NC 模擬物組轉染NC 模擬物，miR-33b 模擬物組轉染miR-33b 模擬物，NC-siRNA 組轉染 NC-siRNA，HMGA2-siRNA 組轉染HMGA2-siRNA，pcDNA3.0 組轉染 pcDNA3.0 空白質粒，pcDNA3.0+miR-33 模擬物組轉染pcDNA3.0空白質粒及miR-33b 模擬物，pcDNA3.0-HMGA2+miR-33b 模擬物組轉染 pcDNA3.0-HMGA2 質粒及miR-33b 模擬物。轉染時，采用 Lipofectamine 2000 試劑進行轉染、 按照試劑說明書進行轉染的操作，模擬物、siRNA 的終濃度均為50nmol/L，質粒的終濃度為 1.2μg/ml。

1.3 細胞遷移的Transwell 檢測 Eca9706 細胞用無血清DMEM 重懸后接種在無基質膠的transwell上層小室內，下層小室內加入600μl 含有10%FBS的DMEM，不同條件處理24h 后用磷酸鹽緩沖液漂洗小室3 遍，用棉簽擦去上層未侵襲的細胞后用4%多聚甲醛固定過夜，第二天用DIO 細胞膜綠色熒光染液對細胞膜進行染色并在顯微鏡下觀察，激發波長484nm、發射波從501nm，在5 個隨機高倍視野下對綠色熒光細胞的數目進行計數、平均值即為侵襲細胞數目。

1.4 細胞遷移的劃痕檢測 Eca9706 細胞接種在6孔板中,用200μl 的移液頭在培養孔底部中央做一縱行劃痕并在顯微鏡下拍照記錄, 劃痕面積記為A0；不同條件處理24h 后，再次在顯微鏡下拍照記錄，劃痕面積記為 A24。按照公式（A0-A24）/A0 計算相對愈合面積。

1.5 熒光定量PCR Eca9706 細胞接種在12 孔板內，不同條件處理24h 后用miRNA 提取試劑盒分離細胞中的miRNA 后用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒將miRNA 反轉錄為cDNA，用miRNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒配置20μl 的PCR 反應體系，miR-33b 的 上游引 物 為 5’-CGAUCGU ACGACUACAGU-3’、 下游引物為試劑盒內的通用引物, 按照程序 95℃ 15s、60℃ 1min 反應 40 個循環,根據循環曲線計算miR-33b 的表達量； 另取E-ca9706 細胞，不同條件處理24h 后用培養細胞/細菌總RNA 提取試劑盒分離RNA、用FastKing 一步法除基因組cDNA 第一鏈合成預混試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，用Talent 熒光定量檢測試劑盒配置 20μl 的 PCR 反應體系，HMGA2 的上游引物為5’-TAAGCTAGTAGCTAGCTA-3’、下游引物為 5’-ATTCGATGCTAGCTACGA-3’，按照程序 95 ℃15s、60℃ 1min 反應40 個循環，根據循環曲線計算HMGA2 的 mRNA 表達量。

1.6 Western blot Eca9706 細胞接種在12 孔板內，不同條件處理24 小時后用蛋白裂解液提取總蛋白,用BCA 試劑盒測定蛋白濃度后取30μg 蛋白與上樣緩沖液混合,加入預先配置好的聚丙烯酰胺分離膠和濃縮膠，80V 電壓電泳至分離膠和濃縮膠交界處，調整至110V 電壓、電泳至指示條帶接近分離膠下緣，停止電泳后300mA 轉膜80min，將NC膜放入5%脫脂牛奶封閉2h，加入HMGA2 第一抗體、4℃孵育過夜。第二天，TBST 洗膜3 遍后加入第二抗體、 室溫孵育2h，TBST 洗膜3 遍后加入顯影液、在化學顯影儀中曝光得到蛋白條帶，分析灰度值并根據HMGA2 灰度值與β-actin 灰度值的比值計算表達量。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測 構建包含HMGA2 mRNA 3’UTR 序列的雙熒光素酶報告基因,將雙熒光素酶報告基因與NC 模擬物或miR-33b 模擬物共同轉染進入Eca9706 細胞，48 小時后用胰蛋白酶消化收集細胞,采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒在GloMax 2020 單管型發光檢測儀上測定螢火蟲熒光值和海腎熒光值, 以螢火蟲熒光值/海腎熒光值計算熒光素酶報告基因的熒光活性。

1.8 統計學分析 采用SPSS23.0 軟件錄入數據，兩組間計量資料的比較采用t 檢驗、三組間計量資料的比較采用方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-33b 模擬物對Eca9706 細胞遷移的影響與NC 模擬物組比較，miR-33b 模擬物組細胞中miR-33b 的表達量明顯增多 (P＜0.05), 見圖1A；transwell 實驗顯示，與NC 模擬物組比較，miR-33b模擬物組細胞的遷移數目明顯減少(P＜0.05),見圖1B；劃痕實驗顯示,與NC 模擬物組比較,miR-33b模擬物組細胞的相對愈合面積明顯減少 (P＜0.05）,見圖1C。

圖1 miR-33b模擬物對Eca9706 細胞遷移的影響

2.2 miR-33b 模擬物對 Eca9706 細胞中 HMGA2的靶向調控作用 經TargetScan 網站進行生物信息學預測，miR-33b 能夠靶向結合HMGA2 mRNA的 3’UTR,見圖2A；經 western blot 檢測，與 NC 模擬物組比較，miR-33b 模擬物組細胞中HMGA2 的蛋白表達量明顯減少（P＜0.05）,見圖2B；經雙熒光素酶報告基因檢測,與NC 模擬物組比較，miR-33b模擬物組細胞的熒光活力明顯降低（P＜0.05）,見圖2C。

2.3 沉默HMGA2 對Eca9706 細胞遷移的影響 與NC-siRNA 組比較，HMGA2-siRNA 組細胞中 HMGA2 的表達明顯減少(P＜0.05),見圖3A-B;transwell實驗顯示,與 NC-siRNA 組比較,HMGA2-siRNA 組細胞的遷移數目明顯減少（P＜0.05）,見圖3C；劃痕實驗顯示,與 NC-siRNA 組比較,HMGA2-siRNA 組細胞的相對愈合面積明顯減少(P＜0.05),見圖3D。

圖2 miR-33b模擬物對Eca9706 細胞中HMGA2 的靶向調控作用

圖3 沉默HMGA2 對Eca9706 細胞遷移的影響

2.4 過表達 HMGA2 對 miR-33b 調控 Eca9706 細胞遷移的影響 與pcDNA3.0 組比較、pcDNA3.0+miR-33 模擬物組Eca9706 細胞中HMGA2 的表達量明顯減少（P＜0.05），與 pcDNA3.0+miR-33 模擬物組比較、pcDNA3.0-HMGA2+miR-33 模擬物組細胞中 HMGA2 的表達量明顯增加（P＜0.05）,見圖4A。

劃痕實驗顯示，與 pcDNA3.0 組比較、pcDNA3.0+miR-33b 模擬物組Eca9706 細胞的相對愈合面積明顯減少（P＜0.05），與 pcDNA3.0+miR-33b模擬物組比較、pcDNA3.0-HMGA2+miR-33b 模擬物組細胞的相對愈合面積明顯增加（P＜0.05）,見圖4B。

Transwell 實驗顯示，與 pcDNA3.0 組比較、pcDNA3.0+miR-33b 模擬物組Eca9706 細胞的遷移數目明顯減少（P＜0.05），與 pcDNA3.0+miR-33b模擬物組比較、pcDNA3.0-HMGA2+miR-33b 模擬物組細胞的遷移數目明顯增加（P＜0.05）,見圖4C。

圖4 過表達HMGA2 對miR-33b調控Eca9706 細胞遷移的影響

3 討論

食管癌的發病機制至今仍未明確,臨床上也缺乏治療食管癌的靶向藥物。近年來，miR 被證實在多種惡性腫瘤的發生發展中起到重要作用，其中miR-33b 是一種具有抑癌特性的miR，已經被證實在食管癌、肺癌、多發性骨髓瘤等惡性腫瘤組織中呈低表達趨勢[8-10]。相關的細胞實驗發現，miR-33b對多種惡性腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲均具有抑制作用且其抑制遷移的作用與靶向抑制HMGA2的表達有關。本實驗以食管癌Eca9706 細胞為實驗對象，通過轉染miR-33b 的方式來增加細胞中miR-33b 的表達,在轉染miR-33b 模擬物后觀察到細胞中miR-33b 的表達明顯增多且細胞在Transwell 及劃痕實驗中的遷移明顯受到抑制，說明miR-33b 對食管癌細胞的遷移具有抑制作用。

在胃癌和黑色素瘤中，miR-33b 被證實能夠靶向抑制HMGA2 基因的表達，該基因的編碼產物是一種非組蛋白的染色體構架蛋白，通過“AT-鉤”的結構來與DNA 中富含AT 的結構域結合，進而調節基因表達并產生相應的生物學作用。HMGA2 在食管癌、肺癌、胰腺癌等惡性腫瘤中均呈高表達趨勢[11-14]且多項離體細胞實驗表明，沉默HMGA2 能夠抑制胃腸道惡性腫瘤細胞、宮頸癌細胞、肺癌細胞的遷移[15-17]。在本實驗中，轉染HMGA2-siRNA使食管癌Eca9706 細胞中HMGA2 的表達發生下調后，細胞在Transwell 及劃痕實驗中的遷移也明顯受到抑制，說明HMGA2 參與食管癌細胞遷移的調控、HMGA2 表達的下調能夠使食管癌細胞的遷移受到抑制，結合miR-33b 在其他細胞中對HMGA2 的靶向抑制作用及HMGA2 在食管癌遷移中的作用推測：miR-33b 對食管癌細胞遷移的抑制作用可能與其靶向調節HMGA2 表達有關。

為了驗證這一推測，本實驗首先分析了miR-33b 對食管癌細胞中HMGA2 的靶向作用。MiRs 發揮生物學作用的方式是與靶基因mRNA 的3’UTR以堿基互補配對的方式結合并阻礙mRNA 的翻譯、抑制基因的表達。在Targetscan 中進行生物信息 學 分 析 可 知 ，HMGA2 mRNA 的 3’UTR 上 有miR-33b 的結合位點;將 HMGA2 mRNA 的 3’UTR裝載進入雙熒光素酶報告基因后，miR-33b 能夠使相應雙熒光素酶報告基因的熒光值降低, 說明miR-33b 能夠在食管癌細胞中靶向結合HMGA2 mRNA 的 3’UTR、對 HMGA2 基因表達具有靶向調控作用。在此基礎上，本研究設計了HMGA2 的過表達質粒，通過過表達HMGA2 的方式來進一步驗證miR-33b 通過靶向HMGA2 調控食管癌的遷移，結果顯示：在轉染pcDNA3.0 空白質粒時，miR-33b 模擬物能夠顯著抑制食管癌細胞的遷移；而在轉染pcDNA3.0-HMGA2 治療使HMGA2 表達增加時，miR-33b 模擬物抑制食管癌遷移的作用發生了明顯逆轉，由此證實miR-33b 通過靶向抑制HMGA2 的表達來抑制食管癌細胞的遷移。

綜上所述，miR-33b 能夠直接靶向HMGA2 基因的表達并抑制食管癌Eca9706 細胞的遷移，未來miR-33b 可能成為食管癌治療的新靶點，需進一步實驗來驗證。