微生物菊糖蔗糖酶及在食品中的應用研究進展

倪大偉，徐 煒，張文立,2，沐萬孟,2,

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品安全國際合作聯合實驗室，江蘇 無錫 214122）

自然界中存在兩種果聚糖，按照果糖基之間糖苷鍵的差異，可分為β-(2,1)糖苷鍵連接的菊糖和β-(2,6)糖苷鍵連接的左聚糖（圖1）。左聚糖在植物中含量極少，目前工業上主要以蔗糖為底物，通過果聚糖蔗糖酶（levansucrase，LSase）生產左聚糖[1]；相反地，菊糖在一些植物中含量豐富，尤其是菊科植物，如菊苣、菊芋和大麗花等[2]。作為一種益生元和膳食纖維，菊糖具有許多顯著的生理功能，如抗氧化、促進礦物質吸收、緩解便秘等[2]。食品工業中，菊糖作為膨化劑、增稠劑、脂肪替代品等，常用于冰淇淋、巧克力、酸奶等的生產[3]。

圖1 菊糖和左聚糖結構式[1-2]Fig.1 Structures of inulin and levoglycan[1-2]

一些微生物可以通過菊糖蔗糖酶（inulosucrase，ISase）合成菊糖。微生物菊糖與植物菊糖相比，其分子質量是植物菊糖的數百倍。近年來，以蔗糖為唯一底物，利用ISase合成微生物菊糖受到人們關注。作為一種兼具水解和轉糖基能力的酶，ISase也能夠以蔗糖為果糖基供體，以某些其他糖類為果糖基受體，合成新型低聚糖。

ISase自1973年被發現以來[4]，在新酶挖掘與性質鑒定、構效關系與分子改造等方面的研究不斷被報道。然而，國內關于該酶的研究鮮有報道。本文從近年來學者們對于ISase結構、功能和催化機理的研究出發，總結了在酶分子改造方面，尤其是其產物——菊糖鏈長調控方面的研究進展。重點討論了ISase在食品領域的應用價值，并對其發展趨勢提出合理的展望。

1 ISase的晶體結構

酶分子的結構決定其功能，對酶結構的解析可以通過酶分子改造手段而改善酶的性質，提高酶的應用價值。ISase和LSase同屬于糖苷水解酶GH68家族（http://www.cazy.org/），按照催化口袋的整體構像，又屬于Clan-J家族。目前，總計15 種微生物來源的ISase被鑒定，僅有一種來自Lactobacillus johnsoniiNCC533的ISase（Laje-ISase）被解析了晶體結構[5]。圖2和圖3A分別展示了Laje-ISase的二級結構和三維結構。ISase的整體構象由5 個β-折疊的結構域組成，每個結構域又由4 個反相平行的β-折疊組成。20 個β-折疊共同構成了漏斗狀的催化口袋，這種催化口袋的構象稱為“5-foldβ-propeller”。

除了裸蛋白結構，Laje-ISase與蔗糖和蔗果三糖復合物的共晶結構也被解析出來。由此揭示了在酶催化反應過程中起關鍵作用的3 個氨基酸（稱為催化三聯體），具體為兩個天冬氨酸和一個谷氨酸（D272、D425和E524），分別起到親核試劑、過渡態穩定劑和提供催化質子酸/堿的作用（圖3B）。Laje-ISase的結構顯示，在催化口袋的外圍，有一個Ca2+結合位點，因此，Ca2+可能對酶催化反應活力和穩定性起到一定的影響。一些對酶學性質的研究證明了這一點，如Lactobacillus reuteri121來源的ISase在添加1 mmol/L CaCl2的條件下，酶活力提高了20%以上[6]。

三聯體活性位點的協同作用是ISase和LSase催化反應的共同特征。晶體結構的研究表明，ISase和LSase的催化口袋均采用“5-foldβ-propeller”構象，并且兩種酶三維結構的重合度很高。相似的結構導致ISase和LSase的催化機理和反應進程基本一致。目前，5 種微生物來源的LSase晶體結構已被解析，分別來自Bacillus subtilis[7]、Gluconacetobacter diazotrophicus[8]、Erwinia amylovora[9]、Bacillus megaterium[10]和Erwinia tasmaniensis[11]。ISase和LSase結構上的不同主要在于ISase中無規卷曲結構多，從而蛋白的柔性較大。目前僅解析出一種來源的ISase結構，這可能與其蛋白分子柔性大，不易結晶有關。

圖2 Laje-ISase的二級結構[1,5]Fig.2 Secondary structure of Lactobacillus johnsonii NCC533-ISase (Laje-ISase)[1,5]

圖3 Laje-ISase的三維結構圖[5]Fig.3 Three-dimensional structure of Laje-ISase[5]

2 ISase的催化機理

根據糖苷鍵水解后異頭碳上羥基的構象，糖苷酶的反應機制分為保留機制和反轉機制兩種。通過對糖苷酶的結構分析，涉及催化反應的一對羧基的距離決定了兩種不同的反應機制。糖苷酶的催化位點由兩個酸性氨基酸組成，若兩個氨基酸上羧基的距離在5.5 ?左右，則為保留機制；距離在10 ?左右，則為反轉機制[12]。Laje-ISase在催化過程中，D272和E524的羧基參與反應，二者羧基氧相距6.3 ?（圖3B）。因此，可以判定ISase采取保留機制，催化糖苷水解。

ISase以蔗糖為唯一底物時，表現出3 種主要功能：1）剪切蔗糖；2）將果糖基轉移到另一分子蔗糖上；3）延伸菊糖鏈。因此，當ISase利用蔗糖為唯一底物時，會發生3 種連續的反應，見圖4A。首先，蔗糖的果糖基和葡萄糖基分別結合在ISase的-1和+1位點，D272在催化過程中起到親核試劑的作用，其羧基上的羥基“攻擊”蔗糖果糖基的C2。與此同時，E524羧基上的羥基提供質子酸，形成酶-果糖基復合體中間產物。D425的作用是穩定這一過渡態中間體。其次，在水分子參與下，E524羧基上的羥基氧提供質子堿，果糖基脫離，發生水解反應；相反，如果另一分子蔗糖作為果糖基受體，則會發生轉糖基反應，生成蔗果三糖。最后，不斷延伸的糖分子作為受體，發生聚合反應，菊糖分子不斷延伸。關于ISase正負位點的定義可以理解為：-1位點是供體果糖基的結合位點，+1、+2……+n位點是受體糖鏈糖基結合位點。糖苷鍵的斷裂和形成，發生在-1和+1位點的交界處。

ISase和LSase具有同樣的催化活性中心構象及活性位點，且兩種酶的反應進程幾乎一致。因此，ISase和LSase的催化機制經常被同時討論。目前，學者認為ISase和LSase具有同樣的催化反應機制。保留機制僅針對糖苷鍵水解后異頭物的構象變化而言。催化反應過程包括兩步：蔗糖的斷裂和果聚糖的延伸，因此學者們提出了兩種不同的反應機制來分別描述這兩個過程。

圖4 ISase的反應機制[1,13-15]Fig.4 Reaction mechanisms of ISase[1,13-15]

如圖4A所示，ISase和LSase采取“乒乓機制”，亦稱雙置換機制剪切蔗糖，形成葡萄糖和酶-果糖基復合體中間產物[13]。如圖4B所示，“延續性機制”和“非延續性機制”被用來解釋高分子質量果聚糖和低分子質量果聚糖的形成[14-15]。在果聚糖鏈延伸的過程中，形成的果聚糖始終結合在酶上，這種糖鏈的延伸方式稱為“延續性機制”；相反，如果糖鏈在每次結合新的果糖基后都會從酶上脫落再結合，這種延伸方式稱為“非延續性機制”?！把永m性機制”下形成長鏈產物，而“非延續性機制”形成短鏈產物。

在酶分子采取雙置換機制剪切蔗糖時，3 個活性位點構成的催化三聯體起著絕對的作用。然而，目前關于糖鏈延伸的“延續性機制”和“非延續性機制”所涉及的關鍵氨基酸殘基還沒有被揭示。

3 ISase產物的鏈長調控

ISase以蔗糖為唯一底物時，能夠合成菊糖。菊糖的分子質量因ISase的微生物來源不同而存在差異。微生物菊糖的分子質量通常比植物來源的菊糖高出100～1 000 倍。目前已經測定出分子質量的微生物菊糖不多，包括L.johnsoniiNCC 533（4×107Da（分子質量，下同））[16]、Streptomyces viridochromogenesDSM 40736（2.5×107Da）[17]、Streptococcus mutansJC-2（2×107Da）[18]、Streptococcus mutansGS-5（7×107Da）[19]、L.reuteri121（＞107Da）[6]以及Lactobacillus gasseriDSM 20604（5.858×106Da）[20]。與以上只合成單一分子質量的ISase不同，Leuconostoc citreumCW28來源的ISase合成的菊糖，其分子質量有兩個范圍，分別是低分子質量2.6×103～3.4×103Da和高分子質量1.35×106～1.6×106Da。Bacillus agaradhaerensWDG185來源的ISase是目前已知僅能合成低分子質量菊糖的ISase，合成的菊糖聚分子質量為3×103Da[21]。Aspergillus sydowiIAM 2544是目前鑒定的唯一能合成菊糖的真菌，合成的菊糖分子質量為7×107Da[4]。

多糖的分子質量是影響其性質和功能的重要因素[22-23]，植物菊糖的性質也受分子質量影響[24-25]。通過改變反應條件或利用分子改造的方法，獲得特定分子質量的菊糖，是ISase研究和應用的方向。LSase合成左聚糖的分子質量受到反應條件（底物蔗糖濃度、加酶量和離子強度等）的影響[26]。分子改造是研究ISase產菊糖鏈長調控的主要方式。

Ozimek等[27]報道了對ISase產物鏈長調控的研究，通過研究L.reuteri121來源的ISase，對其-1位點上完全保守的3 個氨基酸進行單點突變，獲得3 個改變產物鏈長的突變體W271N、W340N和R423K。W271N和R423K除了能合成菊糖外，還能合成更多聚合度大于10的低聚果糖，但R423K不能合成聚合度6～10的低聚果糖；W340N對產物鏈長的影響較大，僅能合成蔗果三糖和蔗果四糖。Anwar等[28]也構建了該酶的突變體N543，僅能合成聚合度小于6的低聚果糖，失去合成長鏈菊糖的能力。Rodríguez-Alegría等[29]通過對活性位點附近殘基進行突變，獲得3 個改變產物菊糖鏈長的突變體（S425A、L499F和R618K）。其中S425A和R618K失去合成高分子質量菊糖的能力，產物中只有低聚果糖，表明這兩個位點可能對控制菊糖鏈的延伸起重要作用；L499F保留了合成長鏈菊糖的能力，同時產物中也出現了低聚果糖。

對于鏈長調控的研究，主要集中在對L.reuteri121來源的ISase上。酶法合成多糖的鏈長調控主要通過以下兩種方式：1）消除或減弱底物與酶結合位點的相互作用，可通過將殘基突變為丙氨酸的方式實現；2）阻斷底物結合和糖鏈延伸的通道，可通過將殘基突變為芳香族氨基酸的方式實現[30]。

通過對84 種糖酶的分析發現，在糖分子與酶的結合位點附近，與糖分子產生相互作用的氨基酸，80%以上是酸性氨基酸和極性氨基酸[31]。據此，Charoenwongpaiboon等[31]選擇L.reuteri121來源的ISase底物結合位點周圍、酶分子表面的一些酸性氨基酸和極性氨基酸作為突變位點，發現了兩個可能存在的糖鏈延伸通道：通道A（N543、W551、R483、D479、S482和D478）和通道B（N543、N561、N555和D689）。將這些氨基酸單點突變為丙氨酸，以消除可能與糖鏈存在的氫鍵或極性相互作用。結果發現，這些突變體合成長鏈菊糖的能力均不同程度降低；相反，卻合成了更多聚合度小于10的低聚果糖。尤其是突變體R483A，比野生酶產生了更多蔗果六糖（GF5）。Charoenwongpaiboon等[32]針對該位點采用計算模擬的方法進一步研究第二種鏈長調控方式的作用。只有蔗果五糖（GF4）結合到催化位點，才能經過轉糖基作用產生GF5。因此，通過將GF4與突變體R483A、R483F、R483Y和R483W對接，計算結合自由能ΔGbinding，發現除R483W的ΔGbinding不變外，其余突變體的ΔGbinding均減小。進一步對突變體產物鏈長分布進行研究，發現4 個突變體均比野生酶產生了更多聚合度在4～8的低聚果糖，并且產物的最大聚合度均低于12。

對于ISase的產物鏈長調控，關鍵是找出產物低聚果糖結合的更深層次的位點。目前只獲得了ISase與蔗果三糖的共晶結構，揭示了糖鏈結合的+2位點以及與糖基產生相互作用的氨基酸[5]。因此，獲得ISase與蔗果四糖等更高聚合度寡糖的共晶結構，是揭示糖鏈延伸過程更深層次位點的關鍵，對產物鏈長調控具有重要意義。

4 ISase在食品領域中的應用

4.1 生產高分子質量菊糖

多糖的分子質量是影響其性質和功能的關鍵因素。微生物菊糖和植物菊糖的不同在于二者的分子質量，但二者在性質和功能上的差異，目前還沒有研究涉及。相關左聚糖的研究顯示了高分子質量左聚糖在烘焙方面的優勢[33]。面包中添加等質量高分子質量和低分子質量的左聚糖，結果發現，添加高分子質量左聚糖的面包質地更柔軟且體積更大[33]。因此，微生物菊糖的潛在價值和應用領域值得進一步挖掘。

目前，工業化應用的菊糖是植物菊糖。雖然其來源廣泛，但提取過程復雜，成品中難免會含有其他植物多糖等雜質。酶法合成菊糖是以蔗糖為唯一底物，反應體系中僅含有果糖、葡萄糖、蔗糖、低聚果糖等成分的一種方法，純化過程簡單，產物純度高。微生物菊糖的生產研究發現L.gasseriDSM 20604來源的ISase在最適條件下可產生53 g/L的菊糖。另外，除了蔗糖，制糖工業的副產品如糖蜜等，也具有作為酶法生產菊糖的潛力，該方法不僅能降低成本，還有利于資源的綜合利用。

4.2 生產低聚果糖

低聚果糖作為一種重要的益生元，具有促進腸道菌群平衡等諸多生理功能，被廣泛應用于食品和醫藥等領域[34]。低聚果糖是菊糖形成的前期產物，因此，含有菊糖的植物體內都會積累低聚果糖。目前工業生產的低聚果糖主要通過內切菊粉酶水解菊糖獲得[35]，或利用呋喃果糖苷酶以蔗糖為底物獲得[36]。

通過鏈長調控的手段控制產物的鏈長，使ISase失去形成長鏈菊糖的能力，可以有效提高其生產低聚果糖的能力。通過利用生產低聚果糖的突變體R483A，可制備酶交聯聚集體，以50 g/L的蔗糖為底物，在優化的條件下反應4 h，低聚果糖的產量達到12 g/L[37]。利用食品級釀酒酵母蛋白表達系統可異源表達L.reuteri121來源的Isase，通過截斷部分序列和引入高效信號肽的方式，使ISase高效表達。分批補料發酵生產聚合度在2～20的中鏈低聚果糖，從300 g/L的蔗糖中獲得128.4 g/L的低聚果糖，轉化率達85.6%[38]。最近的研究表明，短鏈低聚果糖，尤其是蔗果三糖，在改善腸道環境和促進免疫系統方面有著比長鏈低聚果糖更顯著的作用[39]。此外，與其他短鏈低聚果糖相比，蔗果三糖在甜度、生物活性以及作為益生元等方面表現出更好的性能[40]。Charoenwongpaiboon等[41]通過固定化的手段提高ISase的穩定性和循環利用效率、控制反應條件，成功生產出以蔗果三糖為主要成分的低聚果糖。

4.3 生產新型低聚糖

根據ISase分別以H2O和蔗糖作為受體，發生水解和轉糖基反應的這一進程，定義水解活力和轉糖基活力。水解活力導致副產物果糖和葡萄糖的產生，轉糖基活力則生成菊糖。轉糖基的能力是糖基轉移酶研究和應用的重點。通過將糖基轉移到常見的分子上，形成自然界中少有或沒有的且具有高價值的產物，是研究具有轉糖基能力的酶的重要方向。研究表明，ISase催化反應過程中，除了H2O和蔗糖可以作為受體分子外，其他一些糖類也可以作為受體，從而形成新型的低聚糖。

Rodríguez-Alegría等[29]首次研究了L.citreum來源的ISase轉糖基能力，以蔗糖和木糖或蔗糖和麥芽糖作為共同底物，發現反應體系中，除了生成菊糖和低聚果糖外，木糖和麥芽糖也可以作為果糖基的受體，生成新型低聚糖，但其未對產物低聚糖進行結構鑒定。

將ISase應用于新型低聚糖生產的研究中，L.gasseriDSM 20604來源的ISase是最常用的。通過對以麥芽糖為受體生成的產物進行結構鑒定，表明生成的麥芽糖基果糖苷的聚合度為3～6，且以α-D-吡喃葡萄糖基-(1,4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1,2)-β-D-呋喃果糖苷和β-D-呋喃果糖基-(2,6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1,4)-α-D-吡喃葡萄糖為主要轉糖基產物[42]。Díez-Municio等[43]以蔗糖和棉子糖為共底物生產新型低聚糖，并對產物低聚糖進行結構鑒定。果糖基通過β-(2,1)糖苷鍵連接在棉子糖的果糖基上，形成聚合度為4～8的棉子糖基果糖苷——α-D-吡喃半乳糖基-(1,6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1,2)-β-D-呋喃果糖基-((1,2)-β-D-呋喃果糖苷)n，且最大產率為33.4%。

目前，對LSase轉糖基反應的研究更加廣泛，這可能得益于LSase更加廣泛的微生物來源。許多糖類、酚類和醇都可以作為果糖基的受體，從而形成新的轉糖基產物[44-46]。這些新型的低聚糖和衍生物在食品、化妝品和醫藥等領域都具有潛在的應用價值。因此，獲得高轉糖基能力的ISase，并篩選可能的受體底物譜，對于提高ISase的應用價值具有重要作用。

4.4 制備菊糖納米材料

建立在高分子質量左聚糖納米材料良好性質和應用價值的基礎上[47-49]，最近，微生物菊糖納米材料的研究也不斷被報道。Jiménez-Sánchez等[50]利用L.citreum來源的ISase生產菊糖，形成了穩定的球狀納米顆粒，顆粒平均直徑為112 nm。菊糖納米顆粒質量濃度在200 μg/mL以下時，對外周血單核細胞不產生毒性作用。溫度對菊糖納米顆粒的形成和顆粒直徑影響顯著，此外，通過優化溫度、蔗糖質量濃度和加酶量等條件，能夠獲得高產量的菊糖納米顆粒[51]。將菊糖納米顆粒與類黃酮（槲皮素和漆黃素）復合，能增加類黃酮的溶解性、穩定性和抗氧化活性[51]。因此，微生物菊糖納米顆?？勺鳛橐环N具有生物相容性的材料，在提高某些天然物質溶解性和防止降解方面具有潛在的應用前景。

5 結 語

蔗糖是自然界中廣泛存在的二糖，其價格低、易制取，是食品行業重要的甜味劑。然而，蔗糖由于致齲齒、易導致肥胖等特點，不能滿足人們對健康飲食的要求。ISase作為一種果糖基轉移酶，能夠以蔗糖為唯一底物生產具有良好性質和功能的菊糖和低聚果糖，有潛力成為蔗糖綜合利用的重要原料。此外，ISase具有轉果糖基的能力，能夠以蔗糖為供體，以其他糖類為受體合成某些非天然有價值的糖類。目前，對ISase的研究主要集中在酶學性質、產物鑒定和分子改造等方面。相比于廣泛研究的LSase，ISase仍有許多值得進一步開發的方面：1）目前只解析出一種來源ISase的晶體結構，這很大程度上限制了學者們對ISase結構和功能的認知。雖然通過計算輔助的理性設計和同源模擬等方式能夠在一定程度上指導分子改造研究，但獲得不同微生物來源ISase的晶體結構，對ISase的結構和功能研究更有指導價值；此外，獲得ISase與產物寡糖的共晶結構，對于闡明糖鏈延伸機制具有重要的指導意義。2）受限于ISase的微生物來源較少，在性質鑒定、酶分子結構解析、分子改造以及受體反應生產新型低聚糖等方面的研究尚不足；因此，探索新來源的ISase，尤其是有較高轉糖基能力的新型ISase，對拓展其應用方面有重要作用。3）蔗糖是ISase的反應底物。制糖工業的副產物，如糖蜜等，其蔗糖含量豐富。因此，以糖蜜為底物，合成菊糖或低聚糖等研究，符合資源綜合利用和可持續發展的要求。