廉價廢棄物厭氧發酵制備生物己酸技術進展

張存勝, 楊 莉, 劉 巖, 霍書豪

(江蘇大學 食品與生物工程學院, 江蘇 鎮江 212013)

1 前 言

作為中鏈羧酸，己酸可用于食品添加劑、醫藥、香料等工業生產[1]。在能源領域，己酸可作為前體原料用于己醇等生產[2]。目前世界每年己酸總需求達到幾十萬噸，但大多源自小型企業，生產規模較小，鮮有己酸年產量在100 t 以上的工廠。工業己酸生產主要由化學法合成，但該法能耗高、污染嚴重，不利于環境和經濟可持續發展。通過提取法可從棕櫚和椰子等作物中獲得己酸，但己酸濃度低、成本高，未被廣泛使用[3]。開發綠色、低成本的己酸制備方法已受到國內外重視[4]。

近幾年，公認的綠色己酸生產工藝是生物法合成己酸，即在微生物作用下將短鏈酸醇通過碳鏈增長合成生物己酸[5]。有研究表明，“低己酸濃度”和“高原料成本”是限制生物己酸應用的“瓶頸”[3,6]。為實現突破，國內外研究人員做了大量研究和努力[7]。本文基于近年來的最新研究結果，對微生物發酵技術制備己酸的研究進行了綜合論述，介紹了幾種代表性的己酸菌并深入剖析它們的代謝合成機理，對影響己酸發酵的關鍵環境因子進行了重點分析與討論，如混合菌群、電子供體、電子受體、pH 等，并以此提出了提高己酸產量的策略。從廉價生產的角度，對可用于己酸生物轉化的廢棄物進行了分類討論，并對廢棄物用于己酸發酵的應用前景進行綜合分析。最后，對生物己酸未來的研究方向進行了展望，以期為后續研究提供指導。

2 己酸發酵微生物及代謝原理

目前報道的產己酸菌有多種，包括Clostridium kluyveri、Ruminococcaceae bacterium CPB6 和Megasphaera elsdenii 等，其中，C. kluyveri 是目前研究最多的菌株，它主要以乙醇(電子供體)和乙酸(電子受體)為底物，在己酸生成的同時伴有副產物丁酸和氫氣產出[8]。己酸菌的代謝途徑如圖1 所示，電子供體與電子受體經過氧化后經過2 個反向β 氧化循環實現碳鏈增長，最終生成己酸[7]，由于此過程將短鏈酸醇轉化為中鏈羧酸，因此被稱為鏈增長過程。

圖1 己酸菌合成生物己酸代謝路徑Fig.1 Metabolic pathway of biocaproate biosynthesis with caproate-producing bacteria

近年來，對己酸發酵的研究多集中在己酸產量提高，表1 列舉了幾種己酸菌利用不同底物進行己酸發酵的報道。2012 年，Weimer 等[8]利用C. kluyveri 在乙酸和乙醇質量濃度分別為7.2 和32 g·L-1條件下獲得質量濃度為12.8 g·L-1的己酸，一度被認為是C. kluyveri 發酵的最高己酸質量濃度。直至2020 年，San-Valero 等[9-10]對C. kluyveri 己酸發酵展開進一步研究，在以乙酸和丁酸作為共同電子受體、恒定pH值(6.8)的條件下，獲得了質量濃度為21.4 g·L-1的己酸，是目前C. kluyveri 菌的最高己酸產量。除C. kluyveri外，采用其他有機質(如乳酸、葡萄糖、甘油、甲醇等)進行己酸發酵的菌株也漸次報道[17-18]，例如，Tao等[12]從產乳酸廢水中分離出一株能夠利用乳酸的己酸菌Ruminococcaceae Sp. CPB6，己酸質量濃度可達16.6 g·L-1。以葡萄糖、蔗糖、甘油、甲醇等為底物的己酸產量相對較低，尚需進一步深入研究。

表1 典型的產己酸菌株Table 1 Typical caproate-producing bacteria

隨著生物技術發展，近年來有研究采用在基因工程與代謝工程手段改造菌株，試圖提高己酸發酵性能。Cheon 等[19]將編碼乙酰輔酶A 乙酰轉移酶(acetoacetyl-CoA thiolase，THL)等5 種酶的基因片段整合到Kluyveromyces marxianus 染色體中異源重構己酸代謝途徑，在微氧環境下利用半乳糖(20 g·L-1)經過12 h 發酵后獲得了0.154 g·L-1己酸。Kim 等[20]在大腸桿菌中添加表達編碼β-酮硫解酶(β-ketothiolase，BKTB)和乙酰輔酶A 轉移酶(acetyl-CoA transferase，ACT)的基因以構建生產己酸的功能菌并下調THL 的表達水平，發酵36 h 獲得了0.528 g·L-1己酸，在縮短發酵時間的同時實現了有氧環境下己酸的合成。楊嬌[21]發現C. kluyveri 的關鍵酶THL 編碼基因過表達后，對菌體的生長和己酸濃度無影響，原因可能是THL在C. kluyveri 菌體內本身具有較高的轉錄水平，導致基因過表達后對己酸代謝無明顯影響。

3 提高己酸發酵性能的策略

3.1 混菌發酵

混菌體系包括開放式混菌體系和人工構建混菌體系，開放式混菌體系通常采用厭氧活性污泥為菌種，其中，己酸菌為優勢菌，各種微生物在體系中共同作用實現己酸轉化[22-23]。因此，與單一菌株體系相比，混菌體系無需滅菌，降低了能耗與經濟成本、對復雜原料操作性強。然而，混菌體系內的己酸合成往往存在底物競爭，包括甲烷化、乙醇氧化為乙酸、羧酸氧化和丙烯酸途徑等[24-25]，導致底物或中間產物損失，進而降低己酸產率。目前抑制甲烷化的策略有：投加產甲烷菌抑制劑(如2-BES 和CHCl3等)、調控體系pH 至弱酸性等[26]。另外，提高氫分壓可限制乙醇向羧酸氧化[24]，降低乳酸濃度可減少乳酸向丙烯酸途徑轉化，但丙烯酸途徑抑制措施尚未見報道。

與污泥體系不同，人工構建的混菌體系能夠對細菌種類精準控制，實現底物的定向轉化。Richter 等[27]將C. ljungdahlii 和C. kluyveri 混合培養，利用C. ljungdahlii 首先將合成氣轉化為乙酸和乙醇，然后利用C. kluyveri 進行己酸生物合成，己酸生成速率達8.1 g·L-1·d-1。另有研究將C. kluyveri 與甲烷菌Methanogen 166 混合發酵[28]，發現甲烷菌能將C. kluyveri 發酵產生的H2轉化為甲烷，消除了高氫分壓引起的反饋抑制。上述研究表明，人工混菌培養能夠克服單一菌種的缺陷，是提高己酸發酵性能的可行策略。

3.2 合理調配電子供體與電子受體比率與濃度

合理的電子供體與電子受體配比有利于提高己酸轉化率，由圖1 顯示，乙酰輔酶 A 是己酸合成的重要前體物質，它是由電子供體的氧化產生，且電子供體氧化過程會產生煙酰胺脈噁呤二核苷酸(NADH)，為下游代謝提供能量，這表明電子供體是引導己酸合成的重要動力和物質來源[29]。C. kluyveri 利用乙醇合成己酸的反應式(1)～(4) (見表2)[9]。若要獲得較高己酸產量，需提供較高的乙醇質量濃度，然而當質量濃度超過32 g·L-1時，乙醇將會對C. kluyveri 細胞產生抑制，導致己酸濃度降低[8]。乳酸作為電子供體向己酸轉化的反應如式(5)～(7) (見表2)[7]，以乳酸為底物進行己酸發酵可獲得較高的己酸產量，例如，Zhu等[30]以乳酸為底物進行己酸發酵獲得的己酸產量達23.41 g·L-1。但有研究發現，乳酸質量濃度超過14.6 g·L-1時，部分乳酸將通過丙烯酸競爭途徑生成丙酸，限制己酸的進一步合成[17]。葡萄糖也可作為電子供體實現己酸轉化，如圖1 所示，葡萄糖為電子供體時產生的能量不足以供應反向β 氧化的持續進行，導致大量副產物(如丁酸)產生[31]。為了克服單一糖類電子供應不足的問題，有研究將葡萄糖與果糖、蔗糖混合發酵，即以混合糖為共同電子供體，結果表明己酸產量可由4.1 提高到13 g·L-1[31-32]，這表明共同電子供體能夠為己酸合成提供更多的能量，提高己酸轉化率。

表2 以乙醇和乳酸為電子供體進行生物己酸合成的反應式Table 2 Reaction equations of biocaproate production using ethanol and lactic acid as electron donors

除電子供體外，電子受體是己酸合成的重要物質，控制電子供體與電子受體的比率對己酸產量提高具有重要作用。有研究表明，當乙醇與乙酸摩爾比為3:7 時，由于電子供體不足導致己酸質量濃度低于1.0 g·L-1，當乙醇與乙酸摩爾比為7:3 時，己酸質量濃度達到3.11 g·L-1，更高的比值將導致己酸菌生長代謝受抑制[11]。值得注意的是，理論上乙醇與乙酸摩爾比為2:1，如表2 反應式(4)所示，此時乙醇和乙酸可被完全利用[33]。但實際發酵過程中乙醇與乙酸摩爾比往往需大于2:1，這是由于乙醇除向乙酰輔酶A轉化外，部分還需氧化為乙酸為代謝提供動力，如圖1 所示[30]。

3.3 解除發酵抑制因素

發酵體系內未解離己酸對己酸菌的毒性較大，這是由于它可以自由出入細胞膜，影響胞內pH 穩定和酶活，進而抑制己酸的合成[34]。研究表明，未解離己酸的抑制質量濃度為0.2 g·L-1[6]，當未解離己酸質量濃度為0.87 g·L-1時，己酸菌活性將完全被抑制[35]。體系內解離與未解離的己酸質量濃度關系如式(8)所示，中性條件比酸性更有利于降低未解離的己酸質量濃度，以0.2 g·L-1未解離己酸和pH 為7.0 的計算，己酸最高產量為27.8 g·L-1。這說明，除調節pH值外，有必要對己酸進行在線分離以獲得更高己酸產量[14,36]，如液液萃取、膜滲析等[37]。

式中：pKa為某一確定pH 值下的己酸解離平衡常數；cA-和cHA分別為解離和未解離己酸的濃度，mol·m-3。

除未解離己酸外，體系內高濃度乙醇和乙酸對己酸菌也有毒性作用，乙醇的抑制作用在3.2 節已論述。研究表明，當乙酸質量濃度超過20 g·L-1時即產生較高的細胞滲透性，抑制細胞的活性[38]。然而，低濃度乙酸乙醇又將限制己酸產量提高。因此，為避免底物抑制，可考慮采用連續發酵方式提高己酸產量[2,39]。此外，以酸醇廢水為底物進行發酵時，廢水中的氨氮等對己酸發酵會產生抑制作用。研究發現，當氨氮質量濃度達到2.0 g·L-1時，游離的C. kluyveri 細胞活性受到完全抑制。為了提高C. kluyveri 對氨氮的耐受性，采用秸稈對C. kluyveri 細胞進行固定，結果表明，固定化形成的C. kluyveri 生物被膜細胞對氨氮的耐受性明顯提高，氨氮質量濃度達到5.0 g·L-1時固定化細胞仍可進行生長代謝[33]。

3.4 pH 調控

pH 是影響微生物發酵的重要參數，它可影響胞內外質子平衡，也影響底物和代謝物的解離狀態。由式(8)可知，pH 與未解離己酸呈反比，較低的pH 易導致體系未解離己酸濃度升高，產生抑制作用。當pH接近中性時，未解離己酸質量濃度較低，有利于己酸產量的增加[1,40]。研究表明，以乙酸和乙醇為底物時，控制發酵過程中pH 為7.5，C. kluyveri 的己酸質量濃度可達19.4 g·L-1，當pH 控制在6.4 時，己酸質量濃度降至13.3 g·L-1[10]。Yu 等[41]以果蔬廢棄物為原料，在開放式混菌發酵過程中控制pH 為7.5 時己酸產量為14.9 g·L-1，當pH 為5.5 時其產量僅為2.3 g·L-1，這表明中性pH 對己酸發酵極為重要。然而在中性環境下，混菌體系中的產甲烷菌活性較高，甲烷菌對底物消耗量的增大將引起己酸產量的降低。因此，需采用手段抑制甲烷菌的活性，具體方法在3.1 節已論述。

3.5 其他措施

己酸發酵還受氫分壓、溫度、反應器結構和厭氧水平等影響。氫氣是己酸合成的副產物，較高的氫分壓能在一定程度上阻止乙醇氧化為乙酸，降低電子供體的損耗，但氫分壓過高時反向β 氧化過程的能量(ATP)將供應不足，限制己酸的合成[2]。Grootscholten 等[24]研究表明，適宜的氫分壓范圍為3～10 kPa。微生物生長代謝需要在適宜溫度下才能高效進行[42]。多數己酸菌為嗜溫菌(30～40 ℃)，例如，C. kluyveri在溫度為19～45 ℃均可生長代謝，在34 ℃左右可實現快速增殖[43]。Agler 等[26]研究表明，發酵溫度由55降至30 ℃后己酸合成速率明顯提高。另外，反應器結構對己酸生成速率有較大影響，有學者分別對不同反應器(包括上流式厭氧濾池、連續攪拌釜式反應器、厭氧序列式反應器和膨脹顆粒污泥床)研究發現，不同反應器獲得的己酸合成速率差異較大，在0.9～57.4 g·L-1·d-1[4,26]。此外，產己酸菌如Clostridium spp.等均為嚴格厭氧細菌[20]，厭氧水平對己酸發酵影響較大，一般要求氧化還原電位在-200～ -250 mV。有氧氣存在時，胞外氧滲入細胞質后易將NAD(P)H 氧化，不利于己酸代謝途徑中依賴NAD(P)H 的丁酰輔酶A 脫氫酶等維持高活性[44]。為去除發酵體系的氧氣，一般是利用惰性氣體(如氮氣)將體系氧氣置換，并添加一定量的還原劑，如二硫蘇糖醇、Na2S 等化學試劑[45]。

4 廉價己酸發酵原料應用前景分析

使用乙酸、乙醇等純化學品進行生物己酸發酵獲得的己酸成本較高。因此，近幾年的己酸發酵研究多集中在利用廢棄物上，以尋求更為低廉的生物己酸生產成本。廣義上來講，含有豐富電子供體或電子受體的廢棄物均可以被己酸菌利用，然而從經濟角度，低濃度的電子供體或電子受體利用價值不明顯。通過大量文獻查詢發現，生物己酸廉價原料開發主要集中在釀酒副產物、食品廢棄物和工業廢棄合成氣等，另有以酸性乳清[46-47]、纖維素[48]和廢棄甘油[49]等為原料進行己酸發酵的報道，但研究較少。因此，重點分析了釀酒副產物、食品廢棄物和工業廢棄合成氣己酸發酵的應用前景。

4.1 釀酒副產物

釀酒工業每年會產生大量的副產物，據報道每生產1 t 白酒就能產生6～10 t 酒糟和15～25 t 高濃度有機廢水[50]。副產物中往往含有高濃度的乙醇和復雜的有機質等，見表3。有機質通過水解酸化生成乙酸，可供己酸菌作為電子受體使用。由于釀酒廢水中的可溶性物質較高且物質密度相對較低，因此其用于己酸發酵時宜采用半連續或連續發酵。Ge 等[35]以稀釋的啤酒廢水為原料，采用半連續式發酵并串聯硅橡膠膜液-液萃取裝置進行己酸在線萃取，在連續運行的55 d 后獲得的平均己酸生產速率為3.4 g·L-1·d-1。Wu等[51]使用厭氧顆粒污泥膨脹床反應器實現了白酒廢水的己酸連續發酵，發現乙醇和乳酸可同時被作為電子供體被利用，并獲得了10.3 g·L-1·d-1的高己酸合成速率。此外，酒糟是釀酒工業的另一重要副產物，其主要包含糧食殘渣和乙醇。與釀酒廢水不同，酒糟中的纖維素類含量較高，轉化為短鏈脂肪酸需要更長的時間，發酵效率較低。Scarborough 等[52]采用開放式培養體系，以酒糟作為原料、經過252 d 的穩定運行，實現木質素和糖類等向短鏈酸醇轉化，并結合殘存的乙醇實現了己酸的轉化。這表明，以釀酒副產物為原料能夠實現生物己酸轉化，但其工業應用的可行性有待進一步論證。

表3 廉價原料用于生物己酸發酵Table 3 Biocaproate production from the low-cost substrates

4.2 食品廢棄物

我國每年有9 000 余萬噸餐廚垃圾被排放，餐廚垃圾富含高濃度淀粉、蛋白質等營養物質，極易被微生物利用[56]。從化學成分上來看，食品廢棄物的能量密度高，水解酸化產生的高濃度短鏈酸有利于己酸的合成。如表3 所示，食品廢棄物己酸發酵獲得的己酸質量濃度可達14.9 g·L-1[41]，這表明食品廢棄物是一種較為理想的廉價原料。食品廢棄物向己酸的轉化，多數采用2 步發酵，即第1 步通過水解酸化將淀粉等碳水化合物降解為乙酸、丁酸或乳酸等，第2 步己酸菌利用外源乙醇和酸化液進行己酸轉化。采用兩相厭氧發酵將酸化和產己酸過程分離，可有效避免未解離己酸和乙醇的毒性，同時可對兩階段工藝分別調控。乙醇作為電子供體必不可少，采用純乙醇勢必提高己酸成本，以食品廢棄物為原料、通過乙醇發酵獲取廉價乙醇用于己酸發酵更為可行[3]。

4.3 工業廢棄合成氣

工業廢棄合成氣的主要成分是CO、CO2和H2[57]，將合成氣直接排放會對生態環境造成嚴重影響。通過微生物的Wood-Ljungdahl 途徑將合成氣轉化為乙醇和乙酸[58]，可進一步通過鏈增長轉化為生物己酸。與另外2 種廢棄物不同：1)氣體用于發酵存在更多的接觸障礙，即合成氣首先溶解于發酵液才能被微生物利用，溶解速率快慢將影響發酵效率；2)氣體中的物質密度較低，獲得的己酸濃度往往較低，如表3所示，合成氣獲得的己酸濃度明顯較釀酒副產物和食品廢棄物低。然而，合成氣己酸發酵的優勢在于獲得的己酸純度較高，同時合成氣中的抑制物含量較低，不易產生抑制作用。若要獲得高己酸產量，高底物濃度必不可少，可采用提純、濃縮技術將合成氣轉化的乙酸乙醇進行濃縮，為己酸發酵提供更高的底物濃度，但工藝的經濟性有待評估。

4.4 廉價原料的優勢與挑戰

市場調查顯示，工業級乙醇價格在0.40～0.47 萬元·t-1、乙酸0.45～0.5 萬元·t-1，而正己酸價格在2.0～2.6萬元·t-1，這表明己酸發酵能夠實現化學品的高值轉化。與純的乙酸、乙醇化學品相比，采用廉價廢棄物進行己酸發酵能夠大幅降低原料成本，如表3 所示，3 類廢棄物的原料成本十分低廉，甚至可以享受廢棄物排放產生的費用補貼，利用廢棄物進行生物己酸轉化的經濟優勢不言而喻。因此，廢棄物用于己酸發酵的前景十分廣闊。

從技術角度看，利用廢棄物進行己酸生物合成仍存在諸多挑戰，最為突出的問題是己酸產量過低，例如，合成氣獲得的己酸質量濃度僅為1.0 g·L-1[6,55]，低己酸濃度將增加下游分離提純的工藝難度和經濟成本。此外，餐廚垃圾的物料成分復雜，往往會對己酸發酵有一定影響，如高濃度鹽分和油脂等會抑制微生物生長，進而抑制己酸合成。針對上述問題，后續研究應重點集中在己酸產量提高、菌種耐受性、抑制物解除和新工藝開發等。同時需要對發酵的經濟性進行分析和評估，通過優化發酵過程提高生物己酸的經濟性。

5 展 望

厭氧發酵技術合成生物己酸具有廣闊的發展前景，但因己酸產量低尚無在工業應用。未來在以下方面可能取得進展：(1)通過基因工程或酶工程改造己酸菌，提高代謝途徑通量和細胞膜通透性，并以此提高己酸產量和發酵效率。(2)通過脅迫馴化等手段或菌種篩選獲得高耐受性菌株，用于復雜原料的生物轉化。(3)開發己酸在線分離工藝與設備，將己酸進行高效分離以解除己酸對微生物的抑制作用，如功能膜材料制備與分離裝置、高效萃取劑開發等。