晉產小葉黑柴胡藥材質量標準研究

張 妤，蔡翠芳，高曉霞

(1.山西藥科職業學院，山西 太原 030031； 2.山西大學 中醫藥現代研究中心，山西 太原 030006)

小葉黑柴胡BupleurumsmithiiWolff var.parvifoliumShan et Y.Li為傘形科柴胡屬植物，生長于海拔2 700～3 700 m的山坡草地，產于我國山西、甘肅、寧夏等地[1]。小葉黑柴胡藥用部位為干燥的根，味苦，性微寒，具有疏散退熱、疏肝、升陽之功[2-3]，其含有20多種皂苷、30多種揮發油，以及木脂素等成分[4-7]，具有解熱、抗炎、鎮痛、抗肝損傷、抗肝纖維化等藥理活性[7-11]。小葉黑柴胡藥材作為柴胡的地方習用品，有較長的用藥歷史[2，3，7]，主要產自山西省寧武、五寨、神池等地[12]。小葉黑柴胡于1987 年作為地方習用中藥載入《山西省中藥材標準》[2]，目前該標準僅對該藥材的性狀、炮制方法、性味、功能主治、用法用量作了簡單陳述，并不能對藥材質量進行有效控制。因此，本課題通過對收集自晉北地區的6個批次小葉黑柴胡藥材進行性狀、顯微鑒別、薄層色譜鑒別、一般檢查項(水分、總灰分、酸不溶灰分)、醇溶性浸出物等項目的研究，旨在為該藥材質量標準的提升及完善提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 MS-204s十萬分之一電子分析天平(METTLER TOLEDO)；SX2.5-10型高溫箱式電阻爐(北京科偉永興儀器有限公司)；DHG-9075A型鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)；LC-350A超聲清洗器(濟寧魯超儀器廠)；HH-2型數顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)；WHF-203 型三用紫外分析儀(上海精科實業有限公司)；YD-1508B 型輪轉式石蠟切片機(浙江金華益迪醫療設備廠)；生物顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司)；QE-100 g型二兩裝高速中藥粉碎機(武漢市屹立工具有限公司)等儀器。

1.1.2 試藥 硅膠板GF254(銀龍牌，煙臺市化工研究所，批號：20191031)；甲醇(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)、乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)、二甲氨基苯甲醛(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)、硫酸(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)、二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)、乙酸(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)、乙酸乙酯(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)；雙蒸水(自制)。柴胡皂苷a及柴胡皂苷d對照品(批號：110777-201711、110778-201711，中國食品藥品檢定研究院)。小葉黑柴胡藥材共6批次：S1，神池縣西溝，采集日期：2020-07-09；S2，岢嵐縣神塘坪，采集日期：2020-08-19；S3，五寨縣馬家坪，采集日期：2020-07-14；S4，寧武縣牛家嶺，采集日期：2020-07-11；S5，寧武縣寺耳溝，采集日期：2020-07-12；S6，神池縣大泉窊，采集日期：2020-07-10。經山西藥科職業學院蔡翠芳教授鑒定為傘形科植物小葉黑柴胡BupleurumsmithiiWolff var.parvifoliumShan et Y.Li的干燥根。

1.2 試驗方法

1.2.1 性狀鑒別 使用標尺測量小葉黑柴胡根的大小。采用眼看、手摸、鼻聞、口嘗等性狀鑒定的方法直觀地對各批次樣品形狀、表面特征、質地、斷面及氣味等進行鑒別。

1.2.2 顯微鑒別 在小葉黑柴胡根的上部、中部、下部分別切取厚度約1 mm的薄片置載玻片上，滴加蒸餾水(必要時，加熱透化)，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下對各批次樣品進行觀察、測量與拍照。

1.2.3 薄層色譜鑒別 取上述6批小葉黑柴胡根及其根莖分別粉碎，各取0.5 g，分別加甲醇20 mL，使用超聲清洗器超聲(200 W，40 kHz)10 min后，將濾液濃縮(5 mL)制成供試品溶液。另取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d對照品，加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg的對照品溶液。再取對照藥材柴胡0.5 g，同法制成對照藥材溶液。參照《中國藥典》薄層色譜法(通則0502)[13]試驗，分別吸取5 μL供試品溶液、對照藥材溶液與對照品溶液，并點于硅膠G薄層板上，展開劑乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)，展開后取出。晾干噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，放置于紫外光燈(365 nm)下檢視。

1.2.4 一般檢查項 選取晉北6個地區收集的小葉黑柴胡原藥材樣品，粉碎過2號篩，備用，每個批次平行測定3次。水分，按照《中國藥典》(2015年版四部附錄 Ⅸ)[13]中水分測定法項下第二法(烘干法)進行測定?？偦曳?，按照《中國藥典》(2015年版四部附錄 Ⅸ)[13]灰分測定法項下進行測定。酸不溶性灰分，按照《中國藥典》(2015年版四部附錄 Ⅸ)[13]總灰分測定法項下酸不溶性灰分測定。

1.2.5 醇溶性浸出物 選取晉北6個地區收集的小葉黑柴胡原藥材，粉碎過2號篩，備用，每個批次平行測定3次。照《中國藥典》(2015年版四部附錄 Ⅸ)[13]醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法(通則2201)測定，用乙醇作溶劑。

1.3 統計方法

數據統計分析采用SPSS 13.0 統計軟件進行描述性統計，并計算標準差與變異系數。

2 結果與分析

2.1 性狀特征

通過對晉產6批小葉黑柴胡藥材進行性狀鑒別觀察，其性狀鑒別特征(見圖1)：

根呈長圓錐形或圓柱形，多分枝，長度多5～10 cm，直徑0.2～0.8 cm。頂端有殘莖2～10個，部分排列在一個平面。根上部近圓形，有稀疏的不定芽，有時排成兩列，長0.2～0.4 cm。表面黑褐色或淺棕色，具突起的支根痕。質硬而略韌，易折斷；斷面纖維性，皮部淺棕色，多有裂隙，木部黃白色，有放射狀紋理。氣微香，味微苦。

2.2 顯微鑒別

通過對6批小葉黑柴胡原藥材根上部、中部、下部橫切面進行顯微觀察發現，該藥材的顯微特征為：木栓層為10～50余列扁平細胞組成；韌皮部外側油室細胞8～12個，內含黃色油狀物。韌皮部油室較多，排列成2～6層，內含黃色油狀物；形成層成環或不明顯。木質部束放射狀排列，導管束間常見裂隙。見圖2。

注：1.木栓層；2.皮層；3.韌皮部；4.木質部

2.3 薄層色譜鑒別

按照“1.2.3 薄層色譜鑒別”項下的方法對小葉黑柴胡樣品的根及其根莖分別進行測定(見圖3)。6批小葉黑柴胡樣品的薄層色譜基本一致，各條帶無明顯差異。在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點或熒光斑點，且與對照藥材北柴胡薄層色譜存在顯著差異。此外，6批小葉黑柴胡的根莖薄層色譜基本一致，在小葉黑柴胡樣品及對照藥材色譜相應的位置上，斑點或熒光斑點顏色較淡。因此，本方法可有效鑒別小葉黑柴胡。

注：2、4、7、9、13、14為樣品的根；1、3、6、8、11、12為樣品的根莖；5為柴胡皂苷a；10為柴胡皂苷d；15為北柴胡對照藥材。

2.4 一般檢查項

水分：根據減少的重量，計算供試品中含水量(%)，6批藥材水分含量為6.46%～7.40%(見表1)，其中最高值為7.40%，最低值為6.46%，二者相差0.94%。經統計分析，6批藥材水分含量的平均值為(6.99±0.39)%，變異系數為5.58%。通常認為變異系數在100%以上為強變異，變異系數在10%～100%為中等變異，變異系數在0～10%為弱變異。供試藥材樣品水分含量為弱變異，因此暫定藥材水分不得超過9.0%(按平均水分含量1.3倍量計算取整)為標準。

總灰分：對6批小葉黑柴胡灰化后所得殘渣進行稱定，以其質量為依據，計算藥材總灰分含量。6批樣品總灰分為5.22%～7.84%(見表1)，其中，最高值為7.84%，最低值為5.22%，二者相差2.62%。經統計分析，6批藥材總灰分含量的平均值為(6.47±1.07)%，變異系數為16.54%。供試藥材樣品總灰分含量為中等變異，因此暫定藥材中總灰分含量不得超過9.0%(按平均總灰分含量1.4倍量計算取整)為標準。

酸不溶性灰分：對6批小葉黑柴胡酸溶后的殘渣進行稱定，以其質量為依據，計算藥材酸不溶性灰分的含量。6批樣品酸不溶性灰分含量為1.13%～2.12%(見表1)，其中，最高值為2.12%，最低值為1.13%，二者相差0.99%。經統計分析，6批藥材酸不溶性灰分含量平均值為(1.68±0.44)%，變異系數為26.19%。供試藥材樣品酸不溶性灰分含量是中等變異，因此暫定藥材中酸不溶性灰分含量不得超過2.40%(按平均酸不溶性灰分含量1.4倍量計算取整)為標準。

2.5 醇溶性浸出物

依照記錄的質量，計算對應浸出物質量百分比，即供試品中浸出物的含量(%)。6個樣品的醇溶性浸出物含量為22.98%～28.60%(見表1)。其中，最高值為28.60%，最低值為22.98%，二者相差5.62%，經統計分析，6批藥材醇溶性浸出物含量平均值為(25.93±2.09)%，變異系數為8.06%。供試藥材樣品醇溶性浸出物含量是弱變異，因此暫定藥材中醇溶性浸出物含量不得低于18.0%(按平均浸出物含量的0.7倍量計算取整)為標準。

表1 小葉黑柴胡藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含量測定結果

3 討論與結論

柴胡屬植物在中國已有幾百年的藥用歷史，由于各地環境差異，導致品種不盡相同，人們根據歷史使用習慣自產自銷。因此，柴胡屬藥材來源復雜，市場銷售混亂，混淆品較多[14]。而藥材基原確定是制定質量標準的第一步，本課題中的6批次小葉黑柴胡試驗樣品均為實地采集，且同時采集原植株標本，保證了研究的準確性。此外，2批次采于寧武縣，2批次采于神池，1 批次采于五寨，1 批次采于岢嵐，基本覆蓋山西省小葉黑柴胡的主要產區，樣品也具有一定的廣泛性和代表性。

利用性狀鑒定來鑒別藥材簡單、易行且迅速[15]，本課題對收集的所有小葉黑柴胡原藥材樣本進行了鑒別觀察，并總結歸納了小葉黑柴胡原藥材性狀鑒別的特征，涵蓋了根外形、支根數量、表面色澤、殘留莖基、質地及氣味等柴胡性狀差異特征，滿足了藥材流通領域基本鑒別的需求。顯微鑒定是中藥鑒定的重要手段之一，利用藥材的組織構造、細胞形狀特征，達到鑒定藥材真偽的目的[16]，本課題建立的小葉黑柴胡的橫切面中木栓細胞、韌皮部油管、木化纖維群、大口徑導管等特征也可作為小葉黑柴胡生藥鑒別的重要參考，這些特征也可能與藥材品質存在一定的聯系[17]。薄層色譜在植物藥成分的定性與定量分析中應用非常廣泛，可快速有效判斷樣品中的成分及含量[16]。2015 版《中國藥典》規定柴胡藥材的薄層鑒別以柴胡皂苷 a、d 為指標，然而柴胡類藥材基本都含有柴胡皂苷 a、d[18]，但薄層色譜圖能直觀表現出柴胡類藥材皂苷成分的異同及含量差異。圖3顯示，小葉黑柴胡的薄層色譜圖基本穩定一致，與對照藥材柴胡的色譜區別明顯，與小葉黑柴胡根莖一致的薄層色譜也有明顯差異。因此，以柴胡皂苷 a、d 為參照，對比小葉黑柴胡皂苷的含量，可作為比較小葉黑柴胡薄層鑒別的依據之一。

水分、灰分、酸不溶性灰分及浸出物是影響小葉黑柴胡品質的重要指標，這些指標對于小葉黑柴胡藥效的發揮至關重要。中藥材的含水量與其質量關系密切，尤其是在中藥材的生產、加工、儲運及使用過程中，對質量變化起主導作用[19]。本課題中小葉黑柴胡藥材的水分含量在6.46%～7.40%，且變異系數較低，屬于弱變異，故建議水分標準按平均含水量的1.3倍量計算?？偦曳种杆幉慕浉邷責胱苹一髿埩舻臒o機物，由藥材自身含有的無機成分及外來雜質組成，而外來雜質多為藥材在生長、加工與運輸中粘帶的泥土、砂石等無機雜質，是酸不溶性灰分的主要成分，在一定程度上會影響藥材質量[20]。本課題中小葉黑柴胡藥材的總灰分含量為5.22%～7.84%，酸不溶性灰分含量為1.13%～2.12%，變異系數較高，屬于中等變異，故建議總灰分及酸不溶性灰分標準按平均含水量的1.4倍量計算。浸出物是評價中藥材質量的重要功能性指標，是復雜中藥成分的整體反映[16]，本課題中小葉黑柴胡藥材的醇溶性浸出物含量為22.98%～28.60%，變異系數較低，屬于弱變異，故建議乙醇浸出物標準按平均醇溶性浸出物含量的0.7倍量計算。

本課題采用多重指標控制為小葉黑柴胡藥材的質量研究提供了合理依據，由于目前對小葉黑柴胡相關質量標準的報道較少，本課題建立的性狀、顯微、薄層色譜，以及水分≤9.0%、總灰分≤9.0%、酸不溶灰分≤2.40%、醇溶性浸出物≥18.0%等標準可推薦暫定為該藥材的建議標準，既可用于評價晉產小葉黑柴胡藥材的質量，也為其臨床用藥安全、可控提供了科學依據。