3種兜蘭屬植物葉片總RNA提取方法的研究

李國澤，邵亞林，常 瑋，丁 勇*

(1. 西南林業大學 云南省高校林木生物技術重點實驗室，云南 昆明 650224；2. 中國科學院昆明植物研究所資源植物與生物技術重點實驗室，云南 昆明 650204)

【研究意義】兜蘭屬(Paphiopedilum)植物花形奇特，色彩鮮艷，花期長，是極具經濟價值和觀賞價值的蘭科(Orchidaceae)植物之一。但正因其具有奇特性、巨大的觀賞價值和經濟價值等，人為遭到了掠奪性采挖而造成野生資源及其生境破壞嚴重[1]，再加上受分布區域的限制以及兜蘭萎蔫病害頻發等自然因素的影響[2]，很大程度上阻礙了兜蘭屬植物的可持續發展。隨著兜蘭同科不同屬如蘭屬(Cymbidium)、蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis)、文心蘭屬(Oncidium)等觀賞性蘭花在分子方面取得的研究進展[3]，充分利用兜蘭屬植物獨特的生態、資源以及遺傳多樣性等優勢，從分子生物學角度出發開展兜蘭屬植物分子生物學方面的研究，為兜蘭屬植物在種質資源保護及新品種的開發利用提供了新的思路?！厩叭搜芯窟M展】兜蘭因其半橢圓形唇瓣高度特化成兜狀故名“兜蘭”，一般生長于疏灌叢中或林緣，性喜濕潤而溫暖的環境。兜蘭屬植物全球大約有80多個種，分布于亞洲的熱帶和亞熱帶地區。我國有18種，主產西南各省區，華南亦有少量種類分布，其中云南地區分布較多，有14種(占全國的77.8 %，世界的21.5 %)[4]。面對兜蘭屬植物面臨的生境破壞以及人為采集等因素帶來的壓力，羅毅波等[1]在兜蘭保護生物學方面的研究中指出，原地保護、種子繁殖、適時的遷地保護、制定有效的保護策略及措施等對兜蘭屬植物野生資源的保護是必要的。同樣，利用組織培養的方法進行大規?？寺》敝?，亦可以減輕對野生兜蘭植物的采集壓力。兜蘭屬植物離體快繁研究主要集中在兩個方面：一是原生種的無菌播種；二是利用試管內由種子萌發而來的原球莖或小苗進行組織培養[5]。隨著分子生物學技術的發展，加快兜蘭屬植物分子生物學方面的研究，可以為兜蘭屬植物在生長發育、代謝調控機制以及種質資源的開發、利用與保護等多個方面提供基本的分子生物學理論依據。開展兜蘭組織RNA的提取是深入兜蘭分子生物學方面研究的必要前提。而兜蘭屬植物多數葉片革質化、肉質化，且富含酚類、多糖等次生代謝產物，其核酸提取困難[6]，對兜蘭屬植物開展分子遺傳學以及相關功能基因的研究等產生一定阻礙。因此尋找適合兜蘭植物高質量總RNA提取的方法是分子生物學研究的關鍵?！颈狙芯壳腥朦c】以紫紋兜蘭(Paphiopedilumpurpuratum)、長瓣兜蘭(Paphiopedilumdianthum)和杏黃兜蘭(Paphiopedilumarmeniacum)為試驗材料，以RNA試劑盒法、改良CTAB法和2種改良Trizol法(Ⅰ和Ⅱ)提取兜蘭植物葉片總RNA并進行效果比較?！緮M解決的關鍵問題】篩選適合3種兜蘭屬植物葉片高質量總RNA的提取方法，為開展兜蘭屬植物后續分子生物學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為培養于科研基地溫室大棚內的長瓣兜蘭、紫紋兜蘭和杏黃兜蘭3種兜蘭屬植物，成熟健康葉片用蒸餾水清洗表面污物、脫脂棉吸干水分后取樣，按樣品0.1 g試驗要求稱取后置于液氮中速凍，后保存至-80 ℃冰箱中備用。

1.2 總RNA提取方法

以下各方法中，液氮研磨樣品量為0.1 g，最后總RNA用40 μl DEPC處理水溶解，于-80 ℃保存備用。試驗重復3次。

1.2.1 RNA試劑盒法 按照康為世紀全能型植物RNA提取試劑盒(DNase I)說明書操作步驟進行總RNA提取。

1.2.2 改良CTAB法 參考容天聚等[7]的方法并做改良，具體調整為在步驟(2)的基礎上重復使用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提2次；在步驟(4)的基礎上2次使用提前預冷的75 %乙醇進行RNA洗滌。其他步驟均相同。

1.2.3 改良Trizol法(Ⅰ) 在孫國勝等[8]方法步驟的基礎上稍作改動：①取容積為2 mL的離心管，先后加入液氮研磨的植物樣品粉末和Trizol試劑1 mL，立即使用旋渦震蕩儀劇烈振蕩混勻，室溫放置5 min，使其充分裂解；②4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液于另一容積為2 mL的離心管中，加入氯仿200 μl，振蕩混勻，室溫放置15 min；③4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上層水相至另一容積為1.5 mL的離心管中，加入異丙醇500 μl，振蕩混勻，室溫放置15～30 min。④4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，RNA沉于管底，加入75%乙醇1 mL，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；⑤4 ℃ 8000 r·min-1離心10 min，盡量棄上清液；⑥將離心管在超凈工作臺中風干5 min獲得總RNA。

1.2.4 改良Trizol法(Ⅱ) 在1.2.3的基礎上調整為改良Trizol法(Ⅱ)提取總RNA：在步驟①裂解離心管中增加β-巰基乙醇20 μl；在步驟②的基礎上重復使用氯仿抽提2次，并縮短室溫放置時間至5 min；在步驟③的基礎上改變RNA沉淀的環境，為-20 ℃放置10 min；在步驟④的基礎上2次使用75 %乙醇進行RNA洗滌。

1.3 總RNA質量檢測

樣品總RNA先用電泳儀(DYY-8C)電泳檢測(1.0 %的瓊脂糖凝膠，上樣量2.5 μl)，然后通過凝膠成像系統(Universal Hood Ⅱ)觀察其完整性；樣品總RNA濃度和吸光度A260/A280比值采用超微量核酸蛋白濃度測定儀(NanoDrop 2000)測定。使用SPSS 23.0對試驗數據進行統計學分析。

1.4 RT-PCR檢測分析

以綜合評價最優的改良Trizol法(Ⅱ)提取的3種兜蘭總RNA為模板，按康為世紀反轉錄試劑盒(HiFiScript cDNA Synthesis Kit)制備成第一鏈cDNA。從NCBI數據庫中查找獲得3種兜蘭屬植物的1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶基因(rbcL)序列(GenBank：紫紋兜蘭MK161066.1、長瓣兜蘭MF983795.1、杏黃兜蘭LC085347.1)，在3個序列保守區域設計了一對共用特異性引物(F：5′-CACATCGAAGCCGTTGTTGG-3′、R：5′-TAGGGGACGACCGTACTTGT-3′，預期產物均為252 bp)進行RT-PCR擴增。擴增體系25 μl：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μl，cDNA模板2.0 μl，引物F、R各1.0 μl，ddH2O 8.5 μl。擴增程序中，預變性為94 ℃、5 min；然后經94 ℃ 30 s變性、55 ℃ 30 s退火和72 ℃ 1 min延伸程序擴增35個循環；之后72 ℃延伸10 min。1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測為特異性的PCR產物直接送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，以進一步檢測總RNA質量。

2 結果與分析

2.1 總RNA完整性分析

采用不同方法提取獲得的紫紋兜蘭總RNA經電泳檢測結果如圖1所示，RNA試劑盒法提取的總RNA 5.8 S rRNA條帶未顯示，28 S和18 S rRNA條帶雖較完整但較暗，說明該方法提取的總RNA完整性一般、濃度較低。其他3種方法提取的總RNA均顯示28 S、18 S和5.8 S rRNA條帶，改良CTAB法獲得的總RNA存在較明顯的降解現象，完整性差；改良Trizol法(Ⅰ)和改良Trizol法(Ⅱ)提取的總RNA條帶清晰，完整性好；條帶亮度的差異表明總RNA濃度各異，改良Trizol法(Ⅱ)的最高，并依次高于改良CTAB法和改良Trizol法(Ⅰ)。

長瓣兜蘭總RNA凝膠電泳結果(圖2)顯示，4種不同提取方法中，RNA試劑盒法提取的總RNA只可見2條帶(28 S和18 S rRNA)、且亮度較弱，表明其完整性一般，濃度較低。改良CTAB法提取的總RNA雖可見28 S、18 S和5.8 S rRNA條帶，但存在明顯降解現象，表明完整性差。改良Trizol法(Ⅰ)和改良Trizol法(Ⅱ)獲得的總RNA均清晰可見28 S、18 S和5.8 S rRNA條帶、無降解，表明完整性均好；改良Trizol法(Ⅱ)的條帶亮度明顯強于改良Trizol法(Ⅰ)，說明前者的總RNA濃度高于后者。

杏黃兜蘭總RNA電泳檢測結果如圖3所示，改良CTAB法提取的總RNA可見28 S、18 S和5.8 S rRNA條帶，亮度最強，但降解現象較明顯，表明其完整性差。其他3種方法提取的總RNA條帶亮度均較弱，說明濃度均較低；改良Trizol法(Ⅰ)和(Ⅱ)提取的總RNA顯示完整的rRNA 3條帶，而RNA試劑盒法提取的總RNA只可見rRNA 2條帶，表明改良Trizol法(Ⅰ)和(Ⅱ)提取的總RNA完整性好，RNA試劑盒法提取的總RNA完整性一般。

2.2 總RNA純度分析

通常，較為理想總RNA A260/A280的比值應介于1.8 ～ 2.1，低于1.7則表明會有蛋白或其他有機物污染，高于2.2則表明RNA被水解或污染。從表1可以看出，RNA試劑盒法、改良CTAB法和改良Trizol法(Ⅱ)獲得的紫紋兜蘭總RNA A260/A280的比值分別為2.18、1.81和1.86，表明其總RNA純度均較高。而改良Trizol法(Ⅰ)提取的紫紋兜蘭總RNA A260/A280的比值則為1.65，表明其純度低，存在一定的蛋白質等雜質污染。

表1 4種不同提取方法獲得的3種兜蘭植物葉片總RNA的純度分析

RNA試劑盒法、改良Trizol法(Ⅱ)、改良CTAB法和改良Trizol法(Ⅰ)提取長瓣兜蘭總RNA A260/A280的比值(表1)分別為2.11、1.96、1.86和1.54，表明前3種方法提取的總RNA純度高、無雜質污染，后一種方法提取的總RNA純度低、雜質污染嚴重。這與4種不同方法提取紫紋兜蘭總RNA的純度結果相一致。

杏黃兜蘭總RNA純度檢測結果中(表1)，RNA試劑盒法和改良Trizol法(Ⅱ)提取總RNA A260/A280的比值分別為2.10和1.79，表明總RNA純度均較高、無雜質污染，但前者純度優于后者；改良CTAB法和改良Trizol法(Ⅰ)提取的總RNA A260/A280的比值分別為1.44和1.51，表明此2種提取方法所獲得的總RNA均存在嚴重的污染、純度較低。

2.3 總RNA提取效率和得率分析

由表2顯示，采用4種不同提取方法獲得的紫紋兜蘭、長瓣兜蘭和杏黃兜蘭3種兜蘭屬植物總RNA的提取時間、得率及濃度均存在一定差異?？俁NA提取時間RNA試劑盒法最短，為1.0 h；改良Trizol法(Ⅱ)和(Ⅰ)次之，分別為1.5和2.0 h；改良CTAB法最長，約為17.0 h。

紫紋兜蘭總RNA提取得率，改良Trizol法(Ⅱ)最高，為75.93 μg·g-1，顯著高于改良CTAB法(38.28 μg·g-1)、改良Trizol法(Ⅰ) (31.49 μg·g-1)和RNA試劑盒法(18.65 μg·g-1)3種方法；4種方法提取的總RNA濃度與圖1顯示的總RNA亮度相吻合。長瓣兜蘭總RNA提取得率，改良Trizol法(Ⅱ)、改良CTAB法和改良Trizol法(Ⅰ)分別為65.35、46.01和36.40 μg·g-1，提取得率RNA試劑盒法顯著低于其他3種方法(P<0.05)，僅為18.77 μg·g-1，與圖2顯示的凝膠電泳圖像相一致。杏黃兜蘭RNA，改良CTAB法最高，為42.55 μg·g-1；改良Trizol法(Ⅱ)、改良Trizol法(Ⅰ)和RNA試劑盒法分別為26.53、25.31和18.44 μg·g-1，均顯著低于改良CTAB法，與總RNA顯示的條帶(圖3)亮度差異相一致。

2.4 兜蘭屬植物總RNA提取效果評價

評價采用4種方法分別提取3種兜蘭總RNA的效果，紫紋兜蘭和長瓣兜蘭的提取效果均顯示改良Trizol法(Ⅱ)獲得的總RNA完整性、純度和濃度均較好；杏黃兜蘭的提取效果以改良Trizol法(Ⅱ)獲得的總RNA完整性和純度較好，但濃度偏低，雖CTAB法獲得的濃度最高，但完整性和純度很差。針對改良Trizol法(Ⅱ)提取杏黃兜蘭總RNA濃度低的問題，可以通過增加原始材料用量和純化濃縮提高總RNA量獲得。從總RNA提取的完整性、純度、濃度以及提取時間的綜合結果表明，改良Trizol法(Ⅱ)是適合3種兜蘭屬植物高質量總RNA提取的有效方法。

表2 4種提取方法獲得的3種兜蘭植物葉片總RNA的效率和得率分析

2.5 RT-PCR分析

RT-PCR擴增產物電泳(圖4)顯示，從改良Trizol法(Ⅱ)提取的3種兜蘭植物總RNA中均獲得與預期長度相符的、清晰明亮的特異性單一條帶，經測序分析與3種兜蘭已知目的基因rbcL的252 bp序列完全一致。該結果進一步表明，改良Trizol法(Ⅱ)能從3種兜蘭植物中提取高質量總RNA，并能滿足后續分子生物學試驗要求。

3 討 論

分子生物學研究的前提是高質量核酸的獲取，針對不同植物材料或不同組織，尋找適合特定植物核酸提取的方法顯得尤為重要，目前，植物總RNA提取常用的方法有RNA試劑盒法、CTAB法和Trizol法等。

隨著科學技術的發展，應用RNA試劑盒法提取植物總RNA的研究越來越多，RNA試劑盒法具有操作方便，省時省力等優勢。目前已經從核桃(Juglansregia)[9]、冬凌草(Isodonrubescens)[10]、象草(Pennisetumpurpureum)[11]和云南蘿芙木(Ravolfiayunnanenisis)[12]等植物中分離出較高質量的RNA。但由于不同植物組織或器官對應的細胞成分往往存在很大差異，對RNA提取要求也不一樣。研究應用RNA試劑盒法提取的3種兜蘭總RNA純度均較好，但完整性較差，且獲得的RNA濃度低，效果一般。推測RNA試劑盒中的提取液對3種兜蘭組織的裂解不夠徹底，而且RNA試劑盒法需要吸附柱多次過濾和洗滌，造成總RNA得率降低，影響總RNA質量。

CTAB法因避免使用有毒而昂貴的苯酚、異硫氰酸胍和鹽酸胍等試劑而被廣泛應用于多種植物總RNA的提取。應用該方法已獲得松(Pinus)[13]、橄欖(Canariumalbum)[14]、棗(Ziziphusjujuba)的芽和幼葉[15]等植物較理想的總RNA。但是傳統的CTAB法在應用于不同植物組織RNA提取時，可能無法獲得較高質量的RNA[15-18]。因此，在科學研究中通常需要對CTAB法進行改良優化，常見的改良方式有：提取過程中加入β-巰基乙醇、增大提取液濃度和改變沉淀劑[16,19]等。如關玲等[17]通過改進各組分的用量(提取液PVP和CTAB的用量)和濃度(β-巰基乙醇的濃度和NaAc濃度)獲得了草莓(Fragariaananassa)、葡萄(Vitisvinifera)和蘋果(Malusdomestica)等不同類型植物理想的RNA；石樂松等[19]發現，CTAB法結合LiCl沉淀純化DNA是一種高效提取文心蘭(Oncidiumhybridum)RNA的方法；仇碩等[18]同樣通過改良的CTAB法獲得了5種石斛屬(Dendrobium)植物成熟葉片較高純度總RNA。從獲得的3種兜蘭總RNA提取效果來看，應用CTAB法時，除采用上述改良優化策略外，還在提取過程中增加氯仿-異戊醇抽提次數和使用75 %乙醇提前預冷2個步驟。3種兜蘭均存在不同程度的降解，長瓣兜蘭提取效果優于紫紋兜蘭，而杏黃兜蘭RNA提取效果最差。究其原因，可能是CTAB法操作需靜置過夜，該過程導致RNA有所降解。

Trizol法是植物總RNA簡單快速高效提取的一種經典方法。因受不同植物材料和不同植物組織的限制，需要對傳統Trizol法進行改良優化以獲得較高質量的核酸，以滿足后續分子生物學研究的需要。常見的Trizol法改進主要涉及試劑和材料提前預冷、冰上操作、增加乙醇洗滌次數和將RNA干燥環節置于超凈工作臺[20-21]等幾個方面。陳心語等[20]通過將全部實驗操作移至冰上，所有試劑全部預冷處理，加入異丙醇后-20 ℃放置10 min，RNA干燥環節將盛有RNA離心管的冰盒置于超凈工作臺，短時間(不超過3 min)鼓風干燥等操作對Trizol試劑法進行改良，獲得純度及質量均達到理想狀態的番茄(Solanumlycopersicum)成熟葉總RNA。王紅波等[21]通過第一步將裂解液至于-70 ℃冰箱過夜，后續氯仿進行重復抽提、增加乙醇漂洗次數等步驟的改良，所提取的矮牽牛(PetuniahybridaVilm)衰老花瓣總RNA質量好。應用Trizol法提取3種兜蘭總RNA，首先通過增加氯仿抽提、異丙醇沉淀和乙醇洗滌環節的室溫靜置和離心時間，并將RNA干燥環節置于超凈工作臺[20]、縮短風干時間[16]等優化形成改良Trizol法(Ⅰ)，雖能獲得較完整的總RNA，但純度差。因此，試驗在改良Trizol法(Ⅰ)的基礎上進一步優化形成改良Trizol法(Ⅱ)，提取獲得高質量的3種兜蘭屬植物總RNA。改良Trizol法(Ⅱ)的特點是①在原有裂解液的基礎上，加入一定比例的β-巰基乙醇。強還原劑β-巰基乙醇能夠有效去除酚類化合物，防止RNA被氧化；陳宏林等[22]通過優化提取液(加入還原劑β-巰基乙醇)獲得了高質量紅樹(Mangrove)植物總RNA；張燕梅等[23]通過在提取液中加入β-巰基乙醇獲得了劍麻(Agavesisalana)較高質量的總RNA。②在氯仿抽提過程中增加抽提次數(2次)。氯仿能夠有效除去蛋白質和其他雜質，同時抑制RNase活性，保證RNA的完整性，提高RNA的質量，這也是黃國文等[24]在油茶(Camelliaoleifera)葉片高質量總RNA提取方法研究中的觀點；秦亞龍等[16]通過多次氯仿等抽提，獲得質量較好的水茄(Solanumtorvum)果實總RNA。③在異丙醇沉淀步驟中，使用提前預冷(4 ℃)的異丙醇進行RNA沉淀，然后在-20 ℃靜置10 min，消除傳統方法中較長時間(15～30 min)的室溫放置對RNA造成的降解。④在后續采用75 %的乙醇洗滌過程中增加洗滌次數(2次)，目的是進一步去除小離子和殘留的異丙醇[16,21]，有效提高RNA的純度。與傳統Trizol法相比，改良Trizol法(Ⅱ)的提取時間縮短約25 %，顯著提高了提取效率。

采用RNA試劑盒法、CTAB法、Trizol法(Ⅰ)和改良Trizol法(Ⅱ)提取了3種兜蘭總RNA，比較不同提取方法獲得的總RNA質量效果。綜合看，改良Trizol法(Ⅱ)能從紫紋兜蘭、長瓣兜蘭和杏黃兜蘭植物中提取高質量總RNA，具備耗時短、經濟節約等特點。該方法對于其他兜蘭屬或蘭科植物總RNA的提取可提供一定的參考意義。

4 結 論

RNA試劑盒法、改良CTAB法和2種改良Trizol法(Ⅰ和Ⅱ)均能從紫紋兜蘭、長瓣兜蘭和杏黃兜蘭植物葉片中提取總RNA，但總RNA質量差異較大。改良Trizol法(Ⅱ)能從3種兜蘭屬植物葉片中提取獲得質量最高的總RNA，具備省時、經濟的特點。研究建立的3種兜蘭屬植物葉片RNA高效提取的方法，為兜蘭屬植物后續的分子生物學研究奠定了良好的基礎，也為其他復雜植物組織總RNA的提取提供了參考。