胃癌中eIF4A1表達特征及其在胃癌細胞增殖中的作用

韓芳芳

黃河水利委員會黃河中心醫院，河南省鄭州市 450000

胃癌是起源于胃壁黏膜上皮的惡性腫瘤，它的發病率處于消化道惡性腫瘤的首位[1]。大部分胃癌發現時癌變組織已經彌散浸潤超過黏膜下層，屬于中晚期胃癌的范疇，此時患者已錯過實施根治性手術的黃金時期[2]。且化療帶來的不良反應嚴重降低患者生活質量，不利改善預后。因此，尋找新型的治療方案來提高治療有效率以及患者的生存率是當務之急。當前，使用阻斷劑對腫瘤發生發展有緊密聯系的信號傳導通路進行阻斷，繼而實現抑制腫瘤增殖生長、侵襲及轉移是腫瘤治療的熱點之一。有研究表明，真核起始因子4A1(eIF4A1)表達特征與胃癌細胞的轉移有密切聯系[3]。也有研究顯示，eIF4A1能有效結合Silvestrol，繼而影響eIF4A1的活性，但是針對胃癌的此類報道甚少[4]?；诖?，本研究探討胃癌中eIF4A1表達特征及其在胃癌細胞增殖中的作用，具示如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選擇2016年10月—2019年10月我院收治的61例胃癌患者，收集其胃癌組織以及相對應的癌旁正常組織制作標本，直徑為0.5cm，用10%甲醛固定。胃癌及相應癌旁正常組織標本均經過病理學診斷確診?；颊呔椴⒑炇鹜鈺?，本研究經過醫學倫理委員會批準。

1.2 方法 (1)材料準備：準備SGC-7901細胞、eIF4A1、SP免疫組化試劑盒、Silvestrol。(2)eIF4A1檢測：采取免疫組化法。將胃癌組織及癌旁正常組織均切成厚度4μm的切片，置于防脫玻片上，于67℃溫度下烤片2h。進行脫蠟和水化，將切片放入裝有沸騰的抗原修復液的燒杯中，保鮮膜封閉燒杯口，將燒杯沸水浴15min 后取出自然冷卻至室溫，完成抗原修復。PBS清洗3遍后，使用3%過氧化氫浸泡10min；使用5%馬血清室溫封閉30min。滴入1∶300稀釋的一抗eIF4A1工作液，于37℃溫度下孵育2h，使用PBS緩沖液替換一抗做陰性對照，孵育2h。用PBS 緩沖液沖洗3次。滴入1∶500的生物素標識二抗稀釋工作液孵育。加入DAB溶液后在顯色液顯微鏡下觀察，并使用蒸餾水清洗來結束反應。使用蘇木素復染，鹽酸酒精分化，自來水浸泡藍化，然后脫水、封片。免疫組化評分方法[5]：染色強度與染色區域的乘積。染色強度分數：陰性0分，弱陽性1分，中等陽性2分，強陽性3分；染色區域分數：<5% 0分，5%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分。胃癌組織和相對應癌旁正常組織評分結果：0～7 分是低表達，8～12分是高表達。(3)SGC-7901細胞增殖活性及活細胞計數檢測：采用CCK-8法。從-80℃超低溫冰箱中取出SGC-7901細胞，放于37℃水浴箱中解凍。取出細胞凍存管，噴灑75%酒精后放入操作臺。打開內含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，取出4ml放于15ml離心管中，打開凍存管用3ml一次性滴管將細胞移入含4ml培養基的離心管中，充分打勻。將內含細胞懸濁液15ml離心管進行離心處理，結束后除去上清液，加入含10%的培養基3ml反復輕柔吹打至混勻于培養液中，過火細胞培養瓶并打開蓋子，水平放置細胞培養瓶，用滴管吸取含10%胎牛血清的RPMI1640培養基置入細胞培養瓶中，然后再加入離心管中的細胞混液，搖勻。酒精燈過火瓶口及瓶蓋后蓋好細胞培養瓶，然后將其放于5%CO2、37℃的培養箱中培養直至對數生長期。將各組SGC-7901細胞放于75cm2細胞培養瓶中長到90%，上述操作離心除去上清液后加入10%胎牛血清的RPMI1640培養基3ml，混勻后將10μl該細胞混液移入含10μl染料的PCR管中，混勻后將10μl混滴液滴到細胞計數板上，用Countess Ⅱ FL細胞計數儀測定每組活細胞數計數。根據計數結果，用細胞培養基將各組細胞濃度調整為4×104個/ml。96孔板，100μl/孔，3個復孔每板每組，設5個板。將含120μg/ml的Silvestrol(于DMSO溶劑溶解)100μl細胞培養液作為藥物組；將0.5%DMSO的100μl細胞培養液作為對照組。兩組孔板均放在5%CO2、37℃恒溫培養箱中進行孵育作常規培養。2d后將孔中原培養液洗凈，加90μl無血清培養基，檢測前加入CCK-8溶液10μl/孔，置恒溫培養箱中反應1h后，檢測450nm波長處吸光度值(OD值)表示細胞增殖能力。

1.3 評價指標 (1)免疫組化評分比較：統計并比較胃癌組織、癌旁組織中免疫組化評分。(2)eIF4A1表達比較：檢測后，統計并比較胃癌組織、癌旁組織中出現高表達例數。(3)SGC-7901細胞增殖活性及活細胞數計數比較：培養后，比較藥物組及對照組的OD值以及細胞計數。

2 結果

2.1 免疫組化評分比較 胃癌組織中免疫組化評分為(9.11±0.95)分，高于癌旁組織的(7.95±0.78)分，差異有統計學意義(t=7.371，P=0.000)。

2.2 eIF4A1表達比較 檢測后，胃癌組織中eIF4A1高表達率為81.97%(50/61)，高于癌旁組織的14.75%(9/61)，差異有統計學意義(χ2=55.174，P=0.000)。

2.3 SGC-7901細胞增殖活性及活細胞數計數比較 培養后，藥物組中SGC-7901細胞OD值及活細胞計數均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

3 討論

良性腫瘤在發展為惡性的過程中，存在兩個必備條件：(1)基因突變，即解除人體對于癌細胞生長的控制，使其能夠無限繁殖；(2)腫瘤逃逸，即腫瘤細胞擺脫人體免疫系統的殺傷。但是人體系統具備識別異己的能力，腫瘤突變產生新的抗原會被免疫系統識別、殺傷。

表1 兩組SGC-7901細胞增殖活性及活細胞數計數比較

患者在發現胃癌病灶時往往已發展到中晚期，此時化療是主要治療方法，但患者會因化療產生嚴重的不良反應且耐藥率居高不下[6]。當前，對腫瘤細胞特定靶點具有抑制作用的小分子靶向藥物的應用不良反應較輕、耐藥率低等優勢較為明顯，已經成為中晚期胃癌治療的一種有效手段[7-8]。真核起始因子(eIF)是一個蛋白質編碼基因，能夠將核糖體聚集到mRNA中，產生預起始復合體。其中的eIF4A1是一種RNA解旋酶，能夠對相鄰的mRNA帽子周圍的二級結構進行重塑，加速帽子依賴的mRNA翻譯。但是在翻譯的過程中避免不了出現失控翻譯。有研究表明，eIF4A1的過分表達會造成基因翻譯圖譜出現改變，和癌癥的惡性表型有著密切的關系，影響患者癌癥的進展與轉移[9]。對癌細胞內失控的翻譯進行有效控制能夠有效抑制癌細胞的增殖。SGC-7901細胞是胃癌細胞中的一種，該細胞能夠成功移植在免疫抑制的動物腹腔及皮下，是一種臨床應用范圍較廣的細胞模型[10-11]。本研究結果顯示，檢測后胃癌組織中eIF4A1高表達率高于癌旁組織，表明胃癌細胞中eIF4A1表達量高于癌旁細胞。有研究表明，Silvestrol是一種從植物中提取的抑制劑藥物，能夠和eIF4A1進行高效的結合，繼而對eIF4A1基因的活性產生抑制作用[12-13]。本研究結果顯示，培養后，藥物組中SGC-7901細胞OD值及活細胞計數均低于對照組，表明eIF4A1能有效結合Silvestrol，繼而影響eIF4A1的活性以及增殖能力。分析原因可能是Silvestrol作為一種抑制劑類藥物能夠有效降低阻斷SGC-7901細胞的信號傳導通路，繼而降低eIF4A1的活性，實現對腫瘤增殖生長的有效抑制[14-15]。

綜上所述，胃癌細胞中eIF4A1表達量高于癌旁細胞，eIF4A1能有效結合Silvestrol，繼而影響eIF4A1的活性以及增殖能力。