外周血循環腫瘤細胞和腫瘤標志物在評估老年非小細胞肺癌患者化療后療效中的價值

李曉華，李 潔，唐軍偉

(四川省南充市中心醫院/川北醫學院第二臨床醫學院老年病科，四川 南充 637000)

肺癌是我國發病率和死亡率均居首位的呼吸系統惡性腫瘤，50%患者發病年齡在65歲以上，其中非小細胞肺癌(non small cell Lung cancer,NSCLC)在肺癌患者中約占近80%[1]。NSCLC早期無特異性表現，臨床上絕大多數患者確診時已到達晚期，錯失了手術的最佳治療時機而只能進行姑息性放化療，療效不甚滿意。因此，早期對老年NSCLC患者治療療效的準確評估對于及時調整治療方案和預后的改善具有重要的臨床意義。研究[2]指出，外周血循環腫瘤細胞(CTCs)數目與NSCLC放化療后復發和轉移具有重要聯系。神經元特異性稀醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是在肺腺癌和鱗癌患者血清中異常升高表達的一種血清腫瘤標志物，可誘導氧化應激反應[3]；細胞質胸苷激酶-1(Cytoplasmic Thymidine Kinase-1,TK-1)和中期因子(Midkine,MK)均是被研究證實與NSCLC發生發展密切相關的血清腫瘤標志物，但其與NSE和CTCs在評估老年NSCLC患者化療后療效中的價值尚未見相關研究報道?；诖?，本研究探討老年NSCLC患者外周血CTCs和血清NSE、TK-1、MK的表達水平及其與臨床療效的相關性，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:前瞻性選取2017年9月至2019年2月期間于我院收治的86例經病理檢查證實的老年NSCLC患者作為研究對象，86例患者中男性49例，女性37例，年齡60～89歲，平均年齡(74.32±13.57)歲；病理類型為腺癌51例，鱗癌32例，腺鱗癌2例，大細胞癌1例；病理分期Ⅲ期41例，Ⅳ期45例；高分化12例，中分化34例，低分化40例。納入標準：①符合2016年版《中國晚期原發性肺癌診治專家共識》[4]中NSCLC的診斷標準，結合刺激性干咳、咯血、胸痛、發熱、氣促等癥狀，血清腫瘤標志物癌胚抗原、糖類抗原125等指標異常，CT或MRI影像學檢查，并經病理組織學檢查確診為NSCLC者；②腫瘤TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者；③術前未接受放、化療或分子靶向治療者；④預計生存期大于3個月者；⑤入院時血常規及心、肝、腎功能檢查均正常，對化療可耐受，且能在院接受≥2個周期化療者。排除標準：①合并嚴重心、肝、腎功能障礙、免疫系統疾病者；②合并其他惡性腫瘤、血液系統疾病者；③精神、認知障礙等無法配合治療者；④出現腦轉移等遠處轉移者。本研究在獲得醫院倫理委員會審核批準后實施，患者均知情參與本研究。

1.2方 法

1.2.1治療方法:所有患者均接受多西他賽+順鉑的化療方案，在化療第1天給予患者多西他賽75mg/m2靜滴1h；化療第1～3d給予患者順鉑25mg/m2靜滴，以21d為1個周期，兩個療程之間間隔7d，連續化療6個周期。治療期間均給予常規預防胃腸道反應、抗過敏、止吐等對癥處理。

1.2.2療效評估:治療前后，依據《實體瘤療效評價標準》[5]對患者治療效果進行評估，其中完全緩解(CR)：腫瘤病灶徹底消失，無新病灶出現，腫瘤最長徑縮小≥50%，并維持4周以上；部分緩解(PR)：腫瘤病灶的直徑綜合低于基線≥30%；疾病穩定(SD)：病灶兩徑最大垂直經乘積增大或減小<25%，未出現新病灶；疾病進展(PD)：病灶兩徑乘積的增大量≥25%或有新病灶出現。治療有效=(CR+PR)，無效=(SD+PD)。

1.2.3外周血CTCs檢測:化療采集患者外周血7.5mL入Cell Save管，充分混勻后，采用強生公司的Cell-Search自動化檢測系統，采用免疫磁珠方法富集表達上皮細胞黏附分子的上皮細胞，所富集的細胞經固定、透化等處理后采用角蛋白Cytokerins抗體、CD45抗體進行免疫染色，最后經4，6-二脒基-2-苯基吲哚染色完成后，采用多通道熒光顯微鏡分析、鑒定細胞核，并計數，CTCs細胞特征為CK(+)/DAPI(+)/CD45(-)。將CTCs計數>2個判定為CTCs陽性，≤1個判定為CTCs陰性。

1.2.4血清NSE、TK-1、MK檢測:化療前采集患者3～5mL清晨空腹靜脈血，經離心分離血清后取上清液，采用酶聯免疫吸附法對患者血清中的NSE、TK-1、MK水平進行檢測，試劑盒購自賽默飛世爾公司。NSE正常值≤5.2ng/mL。

2 結 果

2.186例老年NSCLC患者治療后臨床療效情況:本研究中86例老年NSCLC患者均順利完成化療，化療后有49例治療有效，包括CR9例和PR40例，治療總有效率為56.98%，為治療有效組；37例患者治療無效，包括SD18例和PD19例，占比43.02%，為無效組。

2.2兩組患者CTCs陽性率及血清NSE、TK-1、MK水平比較:經檢測后，無效組血清NSE、TK-1、MK水平和CTCs陽性率均明顯高于有效組(P<0.05)，見表1。經相關性分析結果顯示，CTCs陽性率與血清NSE、TK-1、MK的表達存在明顯的正相關性(r=0.703、0.685、0.619，均P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者CTCs陽性率及血清NSE TK-1 MK水平比較

2.3老年NSCLC患者化療后無效的單因素分析:結果顯示，兩組在年齡、性別、腫瘤直徑、吸煙史和合并疾病方面比較無明顯差異(P>0.05)，兩組在腫瘤TNM分期、外周血CTCs、血清NSE、TK-1、MK表達方面存在明顯差異(P<0.05)，見表2。

表2 老年NSCLC患者化療后無效的單因素分析n(%)

2.4影響NSCLC患者化療后無效的多因素Logistic回歸分析:以老年NSCLC患者化療后無效作為因變量(治療有效=0，治療無效=1)，將單因素中差異存在統計學意義的因素(腫瘤TNM分期、外周血CTCs、血清NSE、TK-1、MK表達)作為自變量，并進行賦值，見表3。隨后將其納入Logistic回歸模型中，結果顯示外周血CTCs陽性、NSE≥40.0ng/mL、TK-1≥4.5pmoL/L和MK≥0.8ng/mL是老年NSCLC患者化療后無效的獨立預測因素，見表4。

表3 NSCLC患者化療后無效的多因素分析賦值表

表4 影響老年NSCLC患者化療后無效的多因素Logistic回歸分析

2.5血清NSE、TK-1、MK預測老年NSCLC患者化療后無效的ROC曲線分析:結果顯示，血清NSE、TK-1、MK單獨預測老年NSCLC患者化療后無效的ROC曲線下面積分別為0.767、0.735和0.734，均低于三指標聯合預測的ROC曲線下面積0.889(P<0.05)；且血清NSE、TK-1、MK單獨預測老年NSCLC患者化療后無效時的截斷值分別為：45.60ng/mL、4.78pmoL/L和1.18ng/mL，見圖1，表5。

表5 血清NSE TK-1 MK評估患者療效的ROC曲線下面積

圖1 血清NSE、TK-1、MK評估療效的ROC曲線

3 討 論

CTCs是由于診療操作或自發等原因經血管或淋巴系統進入血液循環的腫瘤細胞，是腫瘤發生遠處轉移的重要條件，已被研究證實與NSCLC患者的臨床病理及總生存期具有重要的相關性[6]。血清腫瘤標志物是指腫瘤在發生和發展過程中產生或分泌并釋放到外周中的一種肽類物質，其血清檢測可用于惡性腫瘤的診斷、療效評估和預后。目前，在NSCLC的腫瘤標志物中，NSE、TK-1和MK是臨床上較為常用且較有價值的血清腫瘤標志物，但單一的血清指標檢測具有一定的局限性，臨床上常采用聯合檢測的手段以提高其血清腫瘤標志物的應用價值。本研究主要探討了外周血CTCs和血清NSE、TK-1、MK與老年NSCLC患者臨床療效的關系，對于臨床上指導老年NSCLC患者化療方案的制定具有重要作用。

本研究中經6個月化療，有43.02%的老年NSCLC患者治療后無效，由于86例NSCLC患者均為晚期患者，臨床治療以化療為主，與既往文獻中晚期NSCLC化療的有效率不高，約在30%～50%的報道較為一致[7]。比較無效組和有效組患者的CTCs和血清腫瘤標志物水平發現，無效組血清NSE、TK-1、MK水平和CTCs陽性率均明顯高于有效組，可見CTCs在NSCLC化療后無效患者外周血中呈較高陽性表達率，且血清NSE、TK-1、MK呈較高表達，與國內的研究結果較為一致[8]。本研究中，老年NSCLC化療后無效的多因素分析結果顯示，外周血CTCs陽性、NSE≥40.0ng/mL、TK-1≥4.5pmoL/L和MK≥0.8ng/mL是老年NSCLC患者化療后無效的獨立預測因素?？梢?，CTCs的高陽性率及血清NSE、TK-1、MK的高表達均與老年NSCLC化療后無效具有重要聯系。轉移是腫瘤化療失敗的重要原因，研究指出[9]，CTCs的存在為惡性腫瘤細胞的轉移發展和增殖創造了條件。茍小麗等[10]研究亦發現非小細胞肺癌CTCs陽性率與NSCLC患者療效和預后呈負相關。因而，可以認為，CTCs數目及陽性率可間接反映晚期NSCLC患者體內腫瘤的負荷情況和機體免疫清除能力，對于評估晚期老年NSCLC患者療效和預后具有重要指導作用。進一步的ROC曲線分析結果顯示，血清NSE、TK-1、MK單獨預測老年NSCLC患者化療后無效的ROC曲線下面積均低于三指標聯合預測的ROC曲線下面積，可見以上三項血清腫瘤標志物的聯合檢測對老年NSCLC患者化療后療效的評估具有更高的應用價值。NSE是一種在神經元和神經內分泌細胞中特異存在的糖酵解酶，已被研究證實在NSCLC患者血清中的水平隨著腫瘤的進展而逐漸升高[11]，因而當老年NSCLC患者血清NSE≥40.0ng/mL時，提示老年NSCLC患者化療后失敗的風險較高。TK-1是能催化胸腺嘧啶核苷轉變成單磷酸胸腺嘧啶的一種血清腫瘤標志物，其在NSCLC患者血清中異常高表達與腫瘤組織細胞劇烈增殖有關[12]。TK-1是多種癌癥的診斷和預測指標，當TK-1≥4.5pmoL/L時患者體內腫瘤組織細胞增殖劇烈，即使經過6個周期的化療，其化療后仍存在較大的復發和轉移風險，導致化療失敗。MK是一種肝素結合生長因子，在多種惡性腫瘤細胞中高表達。血清MK升高導致的老年NSCLC患者化療后無效的原因可能與高表達的MK促使腫瘤持續生長浸潤以及促進腫瘤血管生成有關。因此，血清NSE、TK-1和、MK的較高表達和外周血CTCs高陽性表達率均會增加NSCLC患者化療后復發或轉移的風險，導致化療失敗，進一步可說明CTCs陽性率與血清NSE、TK-1、MK的表達分別互為正相關關系，這與本研究中四項指標相關性分析的結果一致。本研究中血清NSE、TK-1、MK的聯合預測對于老年NSCLC患者化療后療效的評估價值更高，可幫助老年晚期NSCCL患者預測化療后是否治療有效進而指導制定治療方案，具有較好的應用價值

綜上所述，外周血CTCs高陽性表達率和血清NSE、TK-1、MK高表達是NSCLC患者化療后無效的重要影響因素，且血清三項聯合檢測對于評估NSCLC患者化療后療效具有較好的應用價值。因而臨床上可通過聯合檢測患者外周血CTCs和血清腫瘤標志物以篩選化療后無效的高風險人群，并制定和調整治療方案，以改善患者預后。