尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉移酶基因UGT2B7和UGT2C1與赤擬谷盜磷化氫抗性關系研究

杜文蔚 陳二虎 王康旭 宋 偉 唐培安

(南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，南京 210023)

尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉移酶(UGTs，UDP-glucuronosyl transferas)是一類廣泛分布于各種動植物、細菌和病毒的多功能超家族酶類，這一類酶能夠將活化的核苷糖供體上的糖基轉移到糖苷配基上，從而改變受體的性質，包括生物活性、溶解性、跨膜運輸等特性[1，2]?；罨暮塑仗侵饕蠻DP-葡糖醛酸、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-木糖等，而受體分子既可以為內源物，也可以是外源物，其中昆蟲體內一般以UDP-葡萄糖為主要糖源[3]。Kaplanoglu等[4]通過轉錄組數據分析發現多條UGT基因在馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)吡蟲啉抗性品系中顯著上調表達，通過RNAi技術沉默UGT2基因后，馬鈴薯甲蟲對吡蟲啉的敏感性顯著提高，表明UGTs基因在馬鈴薯甲蟲的吡蟲啉抗性形成過程中發揮重要作用。李秀霞等[5]發現在小菜蛾(PlutellaXylostella)幼蟲抗性種群中，UGT33AA4的表達量均顯著高于敏感種群(30.7～77.4倍)，RNA干擾抑制UGT33AA4表達后，抗性和敏感小菜蛾幼蟲對氯蟲苯甲酰胺的死亡率分別增加27.3%和29.8%，證明UGT33AA4的過表達與小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性相關。

赤擬谷盜Triboliumcastaneum是一種具有重要經濟意義的世界性儲藏物害蟲，屬鞘翅目(Coleptera)，擬步甲科(Tenebrionidae)，擬谷盜屬(Tribolium)[6]。赤擬谷盜在世界范圍內主要分布于熱帶與溫帶地區[7，8]，在我國至少23個省(區)有分布[9]。此外，赤擬谷盜有臭腺分泌臭液，其分泌物含有致癌物，導致糧食品質下降，尤其對糧食中的粉類物質的危害最嚴重，所以當赤擬谷盜大量發生時，面粉會被嚴重污染形成塊狀，產生腥臭味，顏色改變，使其無法食用，造成極大的經濟損失[10-12]。PH3熏蒸是目前防治儲糧害蟲的主要方式[13]，然而由于長期對PH3單一藥劑的過度依賴，導致赤擬谷盜對PH3產生了嚴重的抗性，對我國的儲糧安全構成巨大威脅[14-17]。轉錄組學研究已經表明，赤擬谷盜不同PH3抗性種群基因表達量存在明顯差異，其中包括2個尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉移酶基因—UGT2B7和UGT2C1基因，二者在赤擬谷盜PH3抗性種群中顯著高表達[18]，然而其在PH3抗性形成過程中的功能尚屬未知。據此，本研究以赤擬谷盜為研究對象，分析UGT2B7和UGT2C1基因在赤擬谷盜不同抗性水平以及PH3熏蒸前后的表達模式；進而通過RNA干擾技術沉默靶標基因，分析赤擬谷盜PH3敏感性變化情況，從而揭示UGT2B7和UGT2C1基因與赤擬谷盜PH3抗性形成的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試昆蟲

赤擬谷盜的敏感和抗性種群分別于2016年采自云南西雙版納農戶(YN)和廣東省深圳某糧庫(SZ)(抗性倍數分別為3.0、862.7倍[19])，并在南京財經大學糧食儲運國家工程實驗室培養至今。在實驗室內以人工飼料(全麥粉∶酵母粉=19∶1)，在恒溫29～31 ℃、相對濕度為70%～80%、無光照的培養箱中飼養。

1.1.2 主要試劑

RNA easy、HiScript3?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、ChamQTMSYBR?qpcr Master Mix(Low Rox Premixed)、T7 RNAi Transciption Kit TR102、50×TAE、Loading Buffer、MiniBEST DNA Fragement Purification Kit Ver.4.0、DNA Marker 500、DNA Marker 2000、溴化乙錠溶液(EB)。

1.2 實驗方法

1.2.1 PH3熏蒸

采用FAO[20]推薦的PH3發生裝置并加以改進，PH3氣體由10%磷化鋅的硫酸反應制備獲得，發生裝置見圖1。

在生物測定的基礎上，得到YN、SZ種群的毒力回歸方程：Y=-10.565+7.465X、Y=-47.249+12.146X，選擇PH3的亞致死濃度LC30進行藥劑處理，其中YN的LC30為23.44 μg/L；SZ的LC30為6 895 μg/L。具體操作如下：將羽化后1周齡成蟲放入熏蒸瓶(各種群分別選取50頭)，用高真空硅脂把熏蒸瓶與玻璃旋塞密封。使用相應量程的氣密性注射器抽取PH3氣體，依次注入熏蒸瓶，輕輕搖勻后置于培養箱中密閉熏蒸。實驗共設置6個脅迫時間點，分別為0、1、2、6、12、20 h，以無藥劑處理作為空白對照。各處理完成后，選取存活的試蟲立即放入液氮冷凍備用，實驗共設置3個生物學重復。

圖1 PH3氣體發生裝置

1.2.2 RNA提取及cDNA合成

選取羽化后1周齡的赤擬谷盜成蟲以及PH3處理不同時間后仍存活的赤擬谷盜成蟲，置于液氮中冷凍保存備用。按照試劑說明書用RNA easy提取上述樣本的總RNA，每個種群均設3個生物學重復。用核酸濃度測定儀測定RNA的濃度和純度，并通過瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶情況，以便進行后續試驗。以上述mRNA為模板，依據反轉錄試劑說明書合成cDNA模板，置于-20 ℃保存。

1.2.3 引物設計

根據GenBank提供的赤擬谷盜UGT2B7和UGT2C1基因序列(登錄號分別LOC100141953、LOC660846)信息，用在線設計軟件Primer-Blast設計定量PCR引物，選擇RPS18(登錄號：XM_968539)與RPL13(登錄號：XM_969211)作為定量PCR的內參基因[21]。定量PCR引物和dsRNA引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其他詳細信息見表1。

表1 mRNA表達分析及dsRNA合成所用引物

1.2.4 實時熒光定量檢測

采用ChamQTM SYBR?qPCR Master Mix (Low Rox Premixed)試劑盒，使用ABI 7500 PCR系統(Applied Biosystems，USA)進行qPCR，每個種群均設3個生物學重復和3個技術重復。qPCR程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃ 30 s，40個循環；熔解曲線程序為：95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s。

1.2.5 dsRNA 的合成與注射

赤擬谷盜UGT2B7、UGT2C1以及和綠色熒光蛋白(GFP)的dsRNA特異性引物序列見表1。使用梯度PCR儀進行PCR擴增，反應體系為：10 μL Tap PCR Master Mix，0.5 μL 上游/下游引物，1 μL cDNA，加去離子水至20 μL，PCR程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，40個循環；72 ℃延伸1 min。產物用MiniBEST DNA Fragement Purification Kit Ver.4.0按照說明進行回收，然后參照T7 RNAi Transciption Kit TR102試劑盒說明書體外合成dsRNA。

選取赤擬谷盜活力良好的五齡幼蟲為試蟲。使用微量注射器將200 ng dsRNA注射入幼蟲體內，對照組注射相等劑量的dsGFP，每組均注射足量幼蟲。注射后置于培養箱中飼養，48 h后分別收集生理狀況良好的赤擬谷盜并凍存于液氮中備用。采用qPCR方法測定注射靶標基因的dsRNA后的沉默效果，反應條件參見1.2.4。

1.2.6 赤擬谷盜PH3敏感性測定

選用赤擬谷盜一周齡成蟲進行RNAi，靶標基因沉默后采用熏蒸法檢測試蟲對PH3的敏感性，以LC30作為PH3處理濃度(YN：23.44 μg/L；SZ：6 895 μg/L)。處理不同時間后觀察試蟲死亡情況并統計死亡率，輕觸蟲體不動為死亡。以注射dsGFP作對照組，每組試驗3個重復，每個重復50頭試蟲。

1.2.7 數據處理與分析

使用2-ΔΔCt方法分析目的基因的相對表達量，試驗結果用平均數±標準方差表示，運用SPSS 17.0軟件的單因素方差分析(One-Way ANOV)中的Turkey式多重比較法，對赤擬谷盜UGT2B7和UGT2C1基因的相對表達量以及死亡率進行顯著性差異分析(P<0.05表示顯著性差異，P>0.05表示無顯著性差異)。

2 結果與分析

2.1 UGT2B7和UGT2C1基因在赤擬谷盜敏感和抗性種群中的表達模式

赤擬谷盜UGT2B7和UGT2C1基因在抗性(SZ)種群中的表達量均高于敏感(YN)種群，二者在極高抗種群SZ中的表達量分別是敏感種群YN的2.70和5.90倍，并具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 PH3脅迫下赤擬谷盜UGT2B7和UGT2C1基因的表達模式

不同時間梯度下，PH3脅迫對赤擬谷盜UGT2B7基因表達量影響見圖2，PH3處理后UGT2B7的表達量在敏感(YN)和抗性種群(SZ)均出現不同程度的上調，兩者的變化規律相似，且均在2 h達到峰值。PH3脅迫處理2 h時間段內(即基因表達量達到峰值時)，敏感種群基因表達量和抗性種群基因表達量分別是未處理組的2.47倍和1.76倍，并且均與其他脅迫時間點基因相對表達量形成顯著差異(P<0.05)。

注：柱形圖表示平均數±SD；不同字母之間表示顯著性差異(P<0.05)；以0 h為對照組。圖2 赤擬谷盜UGT2B7在PH3脅迫后的表達量變化

PH3脅迫后赤擬谷盜UGT2C1基因表達量變化見圖3，結果顯示，各個時間點無藥劑處理組基因表達量與0 h無顯著性差異(P>0.05)，敏感種群經PH3處理不同時間后，UGT2C1基因相對表達量較對照組平均下降了約5.37倍，具有顯著差異(P<0.05)；該基因在脅迫1 h后，其相對表達量無顯著性差異(P>0.05)?？剐苑N群經PH3處理不同時間后，UGT2C1基因相對表達量呈現不斷上升趨勢；處理20 h時的表達量相比未處理組高達8.75倍，存在顯著差異(P<0.05)。PH3脅迫后該基因在敏感和抗性種群中的表達模式不同。

注：柱形圖表示平均數±SD；不同字母之間表示顯著性差異(P<0.05)；以0 h為對照組。圖3 赤擬谷盜UGT2C1在PH3脅迫后的表達量

2.3 UGT2B7和UGT2C1基因沉默對赤擬谷盜PH3敏感性的影響

為進一步解析赤擬谷盜UGT2B7和UGT2C1基因與PH3抗性形成的關系，利用RNA干擾技術分別沉默這兩個基因，并檢測其沉默效率，同時測定試蟲PH3敏感性變化情況。結果顯示，赤擬谷盜分別注射dsUGT2B7、dsUGT2C148 h后，與對照組相比，敏感種群和抗性種群的UGT2B7、UGT2C1mRNA表達水平顯著降低，沉默效率分別是49.4%、41.1%和51.7%、47.6%。

分別沉默UGT2B7、UGT2C1基因后，以PH3處理敏感和抗性種群，分析赤擬谷盜對PH3的敏感性變化情況，結果表明，RNA干擾UGT2B7后，以PH3LC30處理敏感和抗性種群，赤擬谷盜死亡率分別增加27%、22%；RNA干擾UGT2C1后，以PH3LC30處理敏感和抗性種群，赤擬谷盜死亡率分別增加38%、31%。注射dsGFP后，試蟲死亡率無顯著性變化(P>0.05)(圖4)。

注：柱形圖表示平均數±SD；柱上的字母表示顯著性差異(P<0.05)；以dsGFP為對照組。圖4 不同抗性種群赤擬谷盜UGT2B7、UGT2C1基因干擾后對PH3的敏感性檢測

3 討論

與一般化學農藥抗性機理類似，PH3除通過呼吸作用進入蟲體外，亦可通過擴散作用穿透表皮直接進入蟲體[22]。Chaudhry等[23]利用放射性同位素(32PH3)標記的方法，通過提高昆蟲抗性品系的熏蒸濃度，使兩個品系達到相同的PH3攝入量，結果發現，抗性品系的死亡率顯著低于敏感品系，說明昆蟲的解毒作用也參與了PH3抗性的形成。UGTs 是一種廣泛存在于動物、植物和微生物中的重要生物轉化酶，可以催化活化糖供體中的糖基加到受體分子的糖苷配基上，產生可被有效排泄的水溶性物質，從而使毒物得到解毒和消除。本研究通過對UGT2B7和UGT2C1基因在不同PH3抗性種群赤擬谷盜中的定量分析，發現UGT2B7和UGT2C1基因在PH3抗性種群中表達量均呈上調趨勢，抗性種群表達量顯著高于敏感種群，暗示其與PH3抗性形成密切相關。Li等[24]發現，9個UGT基因在多抗小菜蛾品系中過量表達，且其中的UGT40V1、UGT45B1和UGT33AA4可以被5～7種殺蟲劑誘導表達。UGT40V1、UGT45B1、UGT33AA4和UGT2B7和UGT2C1屬于同一個基因家族，其功能可能相似，可能介導了昆蟲的抗藥性上調。為了進一步驗證這兩條基因是否介導赤擬谷盜PH3抗藥性的形成，本研究對PH3敏感與抗性種群赤擬谷盜UGT2B7和UGT2C1基因在PH3脅迫前、后的表達量進行分析，結果表明，UGT2B7基因在敏感和抗性種群中均出現先升后降的應激反應，且均在2 h相對表達量達到峰值，相比未脅迫組顯著上調，但是長時間脅迫后表達量下降，可能是昆蟲產生了適應性調節，從而維持體內蛋白水平穩定。而UGT2C1基因的表達量，在敏感種群試蟲中持續下調，抗性種群持續上調。在敏感種群中的持續下調這一趨勢與實驗前的預測略有差異，對于這一問題會在后續實驗中對其做出進一步檢測與分析；在抗性種群中表達量顯著上調，脅迫20 h后該基因的表達量是對照組的8.75倍。據此推測，抗性種群赤擬谷盜在受到PH3脅迫后可能產生了應激反應等適應性變化，導致UGT2C1表達量在脅迫一定時間后迅速上升，以應對外界的藥劑壓力使赤擬谷盜對PH3的敏感性迅速增強，同時也驗證了在赤擬谷盜抗性種群中UGT2C1表達量呈上調趨勢這一結果。有報道表明茚蟲威處理后甜菜夜蛾(SpodopteraExigua)6個UGT基因表達水平顯著上調[25]，硫丹處理后的斜紋夜蛾(SpodopteraLitura)UGT酶活性于24 h后顯著升高[26]。Lee等[27]發現抗吡唑硫磷果蠅代謝速率明顯高于敏感品系，并且通過熒光同位素14C標記法得出UGT只存在于微粒體酶液中，同時在抗性品系中UGT酶活性明顯高于敏感品系。Kojima等[28]利用高通量轉錄組測序發現，除蟲菊酯可誘導UGT表達量顯著上升，同時經吡蟲啉、啶蟲脒和除蟲脲篩選或者處理后，其體內的UGT的表達量明顯提高，表明UGT與昆蟲對殺蟲劑的解毒代謝關系密切。綜上所述，根據定量結果，我們認為UGT2B7和UGT2C1基因在赤擬谷盜PH3抗性產生中扮演了重要角色，同時發現，赤擬谷盜抗性種群在PH3脅迫時的表達模式也與相關研究結果相似。

為了進一步明確赤擬谷盜PH3抗性產生機理，采用RNA干擾實驗，驗證UGT2B7和UGT2C1基因在PH3抗性產生中所發揮的作用及功能。目前對于UGT家族基因的功能研究最早是在煙芽夜蛾(HeliothisVirescens)中開展，發現UGTs能增強其對有機磷殺蟲劑甲基對硫磷的抗性[29]。王夢瑤[30]采用“葉碟吸收飼喂法 ”對朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)UGT201D3基因進行RNA干擾，研究表明AbR品系在處理后對阿維菌素的的敏感性上升。Li等[31]利用RNA干擾對UGT2B17表達進行沉默，研究其與小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺抗性的關系，結果表明，UGT2B17參與了氯蟲苯甲酰胺的解毒作用，該基因的過表達在小菜蛾的抗氯蟲苯甲酰胺中起著重要的作用。本研究對赤擬谷盜老熟幼蟲進行RNA干擾，使UGT2B7和UGT2C1分別沉默，從而研究其與PH3抗性的關系，PH3敏感性實驗結果表明，UGT2B7和UGT2C1基因沉默后，敏感和抗性種群的赤擬谷盜死亡率都顯著增加，該結果證實UGT2B7和UGT2C1基因在赤擬谷盜PH3抗性形成過程中發揮作用，可能參與了赤擬谷盜對PH3的解毒代謝。

4 結論

UGT2B7和UGT2C1基因在抗性種群中的表達量均顯著高于敏感種群(P<0.05)。敏感和抗性種群赤擬谷盜的UGT2B7和UGT2C1基因的表達量均隨著PH3熏蒸時間的變化而變化，表明這兩個基因可能在赤擬谷盜對PH3產生抗性的過程中起著重要的作用。UGT2B7、UGT2C1基因沉默后，赤擬谷盜對PH3的敏感性顯著提高，進一步表明UGT2B7、UGT2C1基因可能參與赤擬谷盜對PH3的抗藥性的形成。