鹽穗木根際產ACC脫氨酶耐鹽菌株的篩選及鑒定

王偉楠，蘭智勇，喻文麗，孫慶培，李佩琪，樊永紅

（新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046）

鹽穗木（Halostachys caspica）是藜科鹽穗木屬的一類鹽生、旱生多汁半灌木，對鹽分適應性極強，貯水組織發達，是荒漠、半荒漠的主要植物之一［1］。

1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）是乙烯生物合成的直接前體。ACC脫氨酶可以將根部的ACC分解成α-丁酮酸和氨，降低了在高鹽堿度［2-4］、旱［5-6］、水澇［7］、重金屬污染［8］等非生物脅迫條件下植物所產生乙烯的含量。因此，用產ACC脫氨酶的植物根際促生菌（PGPR）接種可促進在脅迫條件下的植物生長。

目前，國內外關于產ACC脫氨酶細菌的研究，主要集中在產ACC脫氨酶菌株的篩選及鑒定［9-11］，產ACC脫氨酶微生物對促進植物在逆境脅迫（鹽堿脅迫、干旱脅迫、重金屬污染等）下生長的能力和定殖情況［2-8］，以及控制ACC脫氨酶合成的基因及相關轉基因技術的應用［12］等方面。獨特的自然地理環境，使新疆成為了典型的干旱地區和鹽堿地的重發區。如何更有效地利用并治理鹽堿地，已成為新疆農業發展的重要任務。本研究從新疆鹽堿地植物根際篩選產ACC脫氨酶的耐鹽菌株，目的在于將ACC脫氨酶活性以及耐鹽性能均較強的菌株，作為植物根際促生菌接種到植物根際，從而提高植物在鹽脅迫下的生存能力，為豐富產ACC脫氨酶的植物根際促生菌的菌種資源及后續制作生物菌肥奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

土壤樣品采自新疆五家渠市103團鹽堿地的鹽穗木根際，裝于無菌自封袋中，保存于4℃冰箱內待用，一部分土樣過篩去雜質后送至新疆農科院測試中心進行測定土壤理化性質，另一部分用于篩菌。

1.1.2 主要試劑

本實驗所用的TSB培養基、PAF培養基、DF培養基、ADF培養基、LB培養基，具體配方參考Penrose等［13］的配方。

1.2 方法

1.2.1 產ACC脫氨酶菌株的初篩

本實驗基于Penrose等［13］和張國壯等［14］的方法上稍作了改變，稱取2 g土樣于100 mL PAF培養基中，30℃ 180 r/min培養24 h后，取1 mL加入50 mL DF液體培養基中，同樣條件培養24 h，再取1 mL上述培養液，加入50 mL ADF液體培養基中，30℃ 180 r/min培養48 h，梯度稀釋后，每個梯度各取200μL，涂布于ADF平板上，30℃培養48～72 h后觀察結果，選取不同菌落形態的菌株進行編號并劃線純化，記錄純化后菌株的菌落形態。

保存時，將純化好的菌株用ADF培養液30℃180 r/min培養至渾濁，取1 mL菌液加入1 mL的20%無菌甘油中混勻至凍存管中，于-80℃保存。

1.2.2 ACC脫氨酶活性測定

ACC脫氨酶可以將ACC分解成α-丁酮酸和氨，本次酶活測定以產物α-丁酮酸作為檢測指標，用2，4-二硝基苯肼作為染料，來測定菌液中α-丁酮酸的含量，從而說明菌株的ACC脫氨酶活力，具體步驟參考Penrose等［13］和Glick等［15］的方法。蛋白質含量的測定選擇考馬斯亮藍法，該實驗重復3次。

酶活的計算方式以每分鐘產出1μmol α-丁酮酸的量為1酶活力單位（U），計算方式參考Bal等［16］和姬文秀等［17］的方法。

1.2.3 耐鹽菌株的篩選

將ADF固體培養基分別調至不同的鹽（NaCl）濃度，再將所篩菌株通過劃線的方式接到這些平板上，30℃培養3～5 d后觀察記錄其生長情況。鹽（NaCl）濃度選擇0%、4%、8%、12%和16%，該實驗重復3次。

選擇耐鹽能力較好且ACC脫氨酶活性高的菌株進行后續實驗。

1.2.4 菌株形態觀察

對所選菌株進行革蘭氏染色和掃描電鏡形態觀察。

1.2.5 生理生化實驗

用所選的菌株做生理生化鑒定實驗。所采用的方法參照《微生物學實驗》［18］和《常見細菌系統鑒定手冊》［19］上有關細菌的生理生化測定部分。本次實驗選擇了石蕊牛奶實驗、葡萄糖、乳糖、蔗糖的糖酵解實驗、明膠水解實驗、淀粉水解實驗、油脂水解實驗和過氧化氫酶實驗這8項，將這8項實驗結果與細菌伯杰氏手冊上的描述進行比對，初步鑒定所選菌株的科屬。

1.2.6 Biolog鑒定

Biolog檢測是通過檢測菌株在一定時間內對不同碳氮源的利用程度，來鑒定菌株種屬關系的一種方法。Biolog專用的微孔板上，除第一個孔是未加任何碳源的蒸餾水外，其他95個孔中加入了95種單一碳氮源和四唑染料。微生物利用了孔內碳氮源，四唑染料就會變成紫色。顏色的深淺說明了碳氮源被利用的程度。不同種類的微生物有不同種類的處理液和微孔板。

將所選菌株劃線接種至牛肉膏蛋白胨培養基上，37℃培養12～18 h后，挑單菌落劃線接種在BUG培養基上，37℃下培養12～24 h。在濁度儀上檢驗接種液的濁度，將接種液濁度調至100后，用Biolog專用的無菌棉簽輕輕蘸取單菌落，接入接種液中，搖勻。再檢測其濁度，濁度控制在95左右即可。將處理液倒在專用的無菌小槽中，用加樣槍吸取小槽中的接種液，加到GenIII板的每一個孔中，記錄好時間，37℃培養24 h后，進行檢測。系統會根據所測微孔板每個孔的OD值，與系統內數據進行比對，從而提供匹配度最高的結果。

1.2.7 16S rDNA測序及系統發育分析

將菌株樣品送至上海生物工程有限公司進行16S rDNA測序，對測序結果進行BLAST比對，并從Ezbiocloud上找到相應的模式菌株的16S rDNA序列，之后利用MEGA7軟件構建系統發育樹，確定其種屬關系。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

從表1中可以看出，所選的3份土樣均是堿性土壤，pH均在9左右，且含鹽量較高，屬于典型的鹽堿地土壤。

表1 土樣理化測試結果

2.2 ACC脫氨酶活性測定

α-丁酮酸標曲的回歸方程為y=0.6043x+0.0175，相關系數為0.9949，考馬斯亮藍標準曲線的回歸方程為y=0.6361x+0.0047，相關系數為0.9973。經3次 測 量（圖1），菌 株W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9和W10的酶比活力依次為3.611、4.921、12.430、2.957、9.412、3.642、2.301、7.671、13.013和1.958 U/mg。其 中W3、W5、W8、W9這4株菌株的ACC脫氨酶活性較高，W9的酶比活力最高，為13.013 U/mg。

2.3 菌株耐鹽堿實驗結果

綜合3次實驗結果（表2），菌株W1、W5、W8、W9的耐鹽能力最強，在12%的鹽濃度下仍能生長，部分實驗結果見圖2。

圖1 各菌株ACC脫氨酶活性測定結果

表2 菌株耐鹽實驗結果

綜合菌株的ACC脫氨酶活性以及其耐鹽能力，選擇兩方面能力都最為突出的W5、W8、W9作為后續實驗的供試菌株。

圖2 菌株耐鹽實驗部分實驗結果

2.4 菌種鑒定

2.4.1 菌落形態及顯微觀察結果

從圖3～圖5可以看出，W5和W8菌落呈白色不透明圓形凸起，為革蘭氏陽性的桿菌，W9菌落呈無色透明圓形凸起，為革蘭氏陰性的桿菌。

2.4.2 生理生化實驗結果

由表3可知，3株菌均能使明膠液化，有過氧化氫酶活性，可以利用葡萄糖，且都能使石蕊牛奶顏色改變并產生凝乳反應。W5和W8可以利用蔗糖，但W9不能。

圖4 W5、W8、W9革蘭氏染色結果

圖5 W5、W8、W9掃描電鏡結果照片

表3 生理生化實驗結果

2.4.3 Biolog鑒定結果

W5在培養48 h后，檢出可利用糊精、N-乙酰-D-葡萄糖胺、L-果糖、乳酸鈉、甘油、α-氨基乙酰-L-脯氨酸、果膠、葡糖醛酰胺、L-乳酸和L-蘋果酸等20多種碳氮源，經系統比對得出最匹配的結果為乳酪短桿菌（Brevibacterium casei），可能性（PROB）為0.704，相似性（SIM）為0.704；W8培養48 h后，檢測出可利用D-麥芽糖、蔗糖、D-松二糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、L-果糖、乳酸鈉、α-氨基乙酰-L-脯氨酸、L-丙氨酸和β-羥基苯乙酸等20多種碳氮源，經系統比對得出最匹配的結果也是乳酪短桿菌（Brevibacterium casei），可能性（PROB）為0.864，相似性（SIM）為0.576；W9經48 h的培養，檢測出可利用D-麥芽糖、D-海藻糖、D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、D-松二糖、棉子糖、α-D-乳糖、蜜二糖、β-甲酰-D-葡萄糖苷、D-水楊苷、α-D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖、L-鼠李糖和D-甘露醇等30余種碳氮源，系統給出的最匹配結果為放射型根瘤菌（Rhizobium radiobacter），可能性（PROB）為0.562，相似性（SIM）為0.562。

2.4.4 16S rDNA同源序列比對和系統發育分析

如表4、圖6和圖7所示，經BLAST后W5和W8匹配度最高的種屬均為短桿菌屬，W5和W8的測序結果經過與乳酪短桿菌標準菌株和其他一些短桿菌屬的序列進行比對后，在系統發育樹上被分在同一分支，說明W5和W8均為短桿菌屬的乳酪短桿菌（Brevibacterium casei）。W9則為根瘤菌屬，親緣關系最近的是普沙根瘤菌（Rhizobiumpusense）。

表4 三株菌的16S rDNA基本信息與核酸序列比對（BlastN）結果

圖6 菌株W5和W8基于16S rDNA構建的系統進化樹

圖7 菌株W9基于16S rDNA構建的系統進化樹

3 討論

本次實驗所得的產ACC脫氨酶菌株，酶比活力在2.3～13.1 U/mg之間，最高為13.013 U/mg。費詩萱等［9］從紅棗根際篩出的產ACC脫氨酶菌株，按本文所用的計算方法，酶比活力在0.5～7.3 U/mg之間，最高為7.218 U/mg，與本實驗相比，都是從植物根際篩得的菌株，測酶活的方法和計算方式也相近，但酶活力的區間和最大值均比本實驗所得的結果要低一些，這可能是由于本實驗所用的土樣性質以及植物本身的抗脅迫能力都有不同；姬文秀等［17］從人參中篩出的產ACC脫氨酶內生細菌的酶比活力在0.2～10 U/mg之間，最高為9.728 U/mg，與本次實驗的結果相比，本次實驗所用方法和計算方式與之相同，酶活力的區間以及最大值稍低于本次實驗，可能是由于菌株的來源不同；代金霞等［20］從檸條根際篩出的產ACC脫氨酶菌株，酶活區間在0.33～2.43 U/mg之間，最高酶活為2.427 U/mg，與本次實驗相比，都是從荒漠植物根際土壤中篩得的菌株，所用方法和計算方式也相同，但本次實驗所得的結果要明顯更高一些，可能與土壤性質以及植物本身抗脅迫能力的差異有關。

在細菌鑒定過程中，本次實驗結合了傳統鑒定方法，基于碳氮源利用的Biolog檢測手段和目前廣泛使用的通過16S rDNA鑒定方法，3種方法相互佐證，各有特點。傳統方法操作繁瑣，且生理生化實驗項目有限，存在一定誤差；Biolog由于數據庫有限，也會存在一定誤差；16S rDNA鑒定方法是現代生物技術發展的結果，數據庫豐富，所以所得結果也較為可靠。本次實驗的W9菌株Biolog檢測結果與16S rDNA鑒定的結果在種水平上并不一致，最終以16S rDNA鑒定的結果為準。Biolog檢測結果不一致，可能是由于在接近菌的生長對數期時，Biolog并未給出鑒定結果，而繼續培養至48 h后過了菌株的對數期，或者其數據庫中沒有普沙根瘤菌的數據這兩方面原因導致。

本次實驗所篩出的W5和W8菌株雖都是乳酪短桿菌，但在酶活和菌體形態，以及碳氮源利用等方面還是有一定程度的不同。在產ACC脫氨酶細菌的文獻中也少有短桿菌屬的菌株報道，這一結果也進一步豐富了產ACC脫氨酶細菌的菌種資源。乳酪短桿菌有能富集重金屬離子［21］，產腈水解酶［22］，合成銀和金的納米顆粒［23］等報道。根瘤菌屬也屬于常見的產ACC脫氨酶的菌屬，有根瘤菌的ACC脫氨酶基因能促進其結瘤［24-25］的報道。普沙根瘤菌也有作為植物根際促生菌，能夠富集鎘污染土壤中的鎘［26］，以及作為油田增油細菌［27］的報道。后續也可以繼續進行對這3株產ACC脫氨酶的耐鹽堿菌株的促生能力、接種效應，以及在植物根際定殖情況等方面研究。

4 結論

本文通過ADF培養基，以ACC為唯一氮源，從3種不同的鹽穗木根際土樣中，篩選出10株菌落形態不同的產ACC脫氨酶的菌株，通過對其ACC脫氨酶活性的測定和耐鹽實驗得出W5、W8和W9這3株菌株有較高的ACC脫氨酶活性，W1、W5、W8和W9這4株菌株均能在鹽（NaCl）濃度12%下生長，有很好的耐鹽能力，故選擇W5、W8和W9這3株進行了后續的實驗。經菌落形態和顯微觀察、生理生化實驗、Biolog檢測、16S rDNA測序、BLAST比對和系統發育分析后，最終鑒定W5和W8為短桿菌屬乳酪短桿菌（Brevibacterium casei），W9為普沙根瘤菌（Rhizobium pusense）。