流動分析儀同時快速測定植物全氮、全磷含量的方法改進

李朝英，鄭 路，2*

（1.中國林業科學研究院熱帶林業實驗中心，廣西 憑祥 532600；2.廣西友誼關森林生態系統國家定位觀測研究站，廣西 憑祥 532600）

氮、磷是植物生長所需的大量元素，直接影響植物的生長發育，同時還參與植物體內許多重要化合物的合成與代謝。準確測定植物氮含量和磷含量對于植物營養診斷，合理施肥有著重要意義［1-3］。植物全氮、全磷消解的經典方法是硫酸-高氯酸消解法、硫酸-雙氧水消解法等。硫酸-雙氧水消解法不使用易爆的高氯酸，一次消解液可同時測定全氮、全磷、全鉀含量，操作安全高效，在相關研究中應用較多［4-6］。植物全氮和全磷含量測定的傳統方法分別是擴散法、半微量凱式法和鉬銻抗比色法等。傳統方法操作繁瑣，易存在人為誤差，檢測效率低，難以滿足批量樣品檢測分析的需求。流動分析儀是近年來迅速發展起來的一種新型檢測分析儀器，因具有自動化程度高，操作簡單，檢測準確高效等優點而得到農林業、環境保護等多領域的關注。張英利等［7-8］先后提出了流動分析儀測定硫酸-雙氧水消解植物全氮和全磷的方法，加標回收率在98.5%～100.5%之間，相對標準偏差小于2%，精密度與準確性較高。黃瑩等［9］使用流動分析儀同時測定硫酸-雙氧水消解甘蔗植株的全氮和全磷，回收率在93%～110%之間，相對標準偏差小于2%；貝美容等［10］采用流動分析儀同時測定硫酸-雙氧水消解橡膠全氮、全磷、全鉀的方法，回收率在99%～102%之間，相對標準偏差小于2%。流動分析儀同時檢測全氮、全磷等多個項目的做法與以往的逐項檢測相比，明顯提高了檢測效率，成效顯著。但是由于大多數植物全氮、全磷含量較高，定容50 mL消解液的全氮、全磷含量仍可達200、35 mg/L，而流動分析儀測定全氮、全磷含量的量程范圍為0～30 mg/L。有研究者在測定植物全氮、全磷含量時，將消解液稀釋定容250 mL或將消解液定容50～100 mL后，根據樣品全氮、全磷含量的預判情況再次稀釋，以降低消解液全氮、全磷含量［6-9］。消解液定容250 mL或多次稀釋的操作繁瑣，純水耗用量大，成本增加。消解液定容器皿體積偏大，占用空間大，操作不便。而多次稀釋中全氮、全磷含量預判及稀釋倍數確定增加檢測人員工作量及難度。即使利用流動分析儀檢測，一個樣品的稀釋及定容約需50 s，批量植物消解液的稀釋定容也需花費一定量的時間及人工，且易出現人為差錯，影響批量樣品的高效檢測。

流動分析儀測定全氮、全磷的原理分別基于Bertfelot反應和磷鉬藍反應。Bertfelot反應是水楊酸鈉、次氯酸與銨根離子在堿性條件下反應生成藍色絡合物，比色測定全氮含量。磷鉬藍反應則是在一定酸度和銻離子存在條件下，磷酸根與鉬酸銨形成的銻磷鉬混合雜多酸被抗壞血酸還原為磷鉬藍，比色測定全磷含量［4-5］。流動分析儀經設置后，即可自動向全氮、全磷測定的兩個通道分別注入相應試劑及消解液，使全氮、全磷顯色液酸堿度分別滿足相應反應要求，保證準確高效地檢測分析。傳統方法中，測定全磷的鉬銻抗比色法原理與流動分析儀的一致，但測定全氮的擴散法和蒸餾法利用高濃度氫氧化鈉堿化消解液，蒸餾出的氨經硼酸吸收，用標準酸滴定得出全氮含量，其檢測原理與流動分析儀不同。此外，傳統方法均為人工檢測，抽樣、加試劑、酸堿度調整及檢測等均由人工完成。目前，流動分析儀測定全氮、全磷含量方法與傳統方法的比較討論較少，所測結果可比性尚不清楚。

為了準確高效地利用流動分析儀同時快速測定植物全氮、全磷含量，有必要對現有方法進一步優化改進，使方法適用于全氮、全磷含量高低不同的植物樣品，減少消解液稀釋的人工操作，避免人為差錯，提高檢測效率及準確性。為此，本實驗以硫酸-雙氧水消解全氮、全磷含量高低不同的植物，對流動分析儀同時測定植物全氮、全磷含量的方法進行改進，分析討論改進方法與擴散法、鉬銻抗比色法測定結果的相關性與差異性，探討流動分析儀同時測定植物全氮、全磷含量改進方法的可行性，為實驗室準確高效、經濟、快捷地檢測植物全氮、全磷含量提供可行的參考與指導，從而滿足批量植物檢測分析的現實需求。

1 材料與方法

1.1 儀器

電子分析天平（萬分之一）；AA3流動分析儀（配置MT7模塊，AACE操作軟件）；烘箱；石墨爐。

1.2 樣品

2018年12月于廣西友誼關森林生態系統國家定位觀測研究站設置在青山實驗場的人工林樣地采集多年生降香黃檀（Dalberqia odoriferaT. Chen）葉1份、多年生格木（Erythrophleum fordiiOliv.）葉2份、多年生紅椎（Castanopsis hystrixA.DC.）葉和枝各11份，多年生馬尾松（Pinus massonianaLamb.）葉24份。共49個樣，依次編號1～49。植物烘干后粉碎，過孔徑0.5 mm篩的植物顆粒在60℃烘箱烘干至恒重，放于干燥器冷卻備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 植物樣品消解

稱取0.0500 g樣品放入50 mL三角瓶中，加3 mL硫酸，放于石墨加熱板消解樣品至醬油狀，三角瓶取下稍冷，逐滴加入雙氧水，至消解液變為澄清狀，繼續加熱30 min，取下冷卻。用水將消解液洗入50 mL比色管中，定容，搖勻備用。樣2、樣3、樣14各制備4個平行消解液。以上植物全氮含量在5～40 g/kg之間，消解液中全氮含量5～40 mg/L之間，全磷含量在0.05～6.10 g/kg之間，消解液中全磷含量在0.05～6.10 mg/L之間，空白不加植物樣品，同上操作。

1.3.2 流動分析儀法

1.3.2.1 試劑 進樣清洗液：25 mL硫酸溶于水，定容至1 L；全磷測定用鹽溶液：5 g氯化鈉溶解于適量水中，定容至1 L；SDS水：0.5 g十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解于適量水中，定容至250 mL；鉬酸銨溶液：6.2 g鉬酸銨，0.17 g酒石酸銻鉀，25 mL硫酸溶于水，定容至1 L；抗壞血酸溶液：1.5 g抗壞血酸溶于100 mL水中；全氮測定用緩沖液：35.8 g磷酸氫二鈉，19 g氫氧化鈉，50 g酒石酸鉀鈉，1.5 mL Brij35溶解于適量水中，定容至1 L；水楊酸鈉溶液：8 g水楊酸鈉、0.2 g硝普鈉溶解于適量水中，定容至200 mL；次氯酸鈉溶液：10%次氯酸鈉溶液2 mL，定容至100 mL；水：1.5 mL Brij35溶解，定容至1 L。以上試劑中SDS為電泳級，其他均為分析純級。

1.3.2.2 儀器條件 流速50個樣/h，樣品對沖時間2 s，進樣時間48 s，清洗時間24 s，儀器默認設置基線和漂移校正，自動基線參比為5%，全氮和全磷兩通道的比色濾光片波長均為660 nm。全氮進樣選擇高濃度進樣，泵管管速為0.23 mL/min；全磷進樣選擇低濃度進樣，泵管管速為0.23 mL/min。

1.3.2.3 AA3流動分析儀-MT7模塊管路 由圖1可見，通道1的10個管路所對應的試劑溶液依次為進樣清洗液、空氣、SDS水、SDS水、空氣、鹽溶液、進樣管、SDS水、鉬酸銨溶液、抗壞血酸溶液。通道2的10個管路所對應的試劑溶液依次為清洗液、空氣、緩沖液、進樣管、空氣、緩沖液、水、水楊酸鈉、次氯酸鈉、水。

1.3.2.4 標準曲線建立 抽取100 mg/L磷標準液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 mL分 別 放 于25 mL容量瓶中，同時抽取1000 mg/L氮標準液0.00、0.30、0.40、0.50、0.75、1.00 mL放 入 上 述25 mL容量瓶中，用1.3.1中的消解空白液定容，搖勻，配制磷、氮混標?；鞓酥辛诐舛葹?、1、2、3、4、6 mg/L，氮 濃度 為0、12、16、20、30、40 mg/L。按流動分析儀上述檢測條件進行測定，建立全磷的標準曲線：y=0.9997x+0.0006（r2=0.9999），全氮的標準曲線：y=0.9993x+0.0129（r2=0.9997）。

1.3.3 傳統方法

1.3.3.1 試劑 甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑：稱取0.099 g溴甲酚綠、0.066 g甲基紅，溶解于100 mL乙醇中；硼酸-指示劑混合溶液：10 g硼酸溶于1 L水中，加入20 mL甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑，用稀酸或稀堿將溶液pH調節至4.5；0.01 mol/L鹽酸溶液：準確抽取8.4 mL濃鹽酸，加水定容至100 mL，配制1 mol/L鹽酸溶液，抽取1 mol/L鹽酸溶液10 mL，定容至1 L，即得0.01 mol/L鹽酸溶液；鉬銻抗顯色劑：153 mL濃硫酸緩慢倒入400 mL水中，攪拌冷卻，取10 g鉬酸銨溶于300 mL水中，將配制的硫酸溶液緩緩加入配制的鉬酸銨溶液中。稱取0.5 g酒石酸銻鉀溶解于100 mL水中后，將其加入鉬酸銨溶液中，定容至1 L，即得鉬銻抗貯存液。取100 mL鉬銻抗貯存液，加入1.5 g抗壞血酸，攪拌溶解即得鉬銻抗顯色劑；2 g/L的2，4-二硝基酚：稱取2 g的2，4-二硝基酚溶解于100 mL乙醇中；2 mol/L氫氧化鈉：稱取80 g氫氧化鈉溶解于少量水中，定容至1 L；98%濃硫酸；丙三醇。以上試劑均為分析純級。

1.3.3.2 擴散法 擴散皿內室中加入2.5 mL硼酸-指示劑溶液，在擴散皿沿及皿蓋塞均勻涂抹丙三醇，抽取消解液5 mL，加入擴散皿外室一側，在外室另一側加入10 mL的10 mol/L氫氧化鈉溶液，立即用皿蓋塞密封皿口，轉動皿蓋，排出皿蓋塞與皿沿間的空氣，以達到良好密封的效果。左右輕旋擴散皿，使外室的消解液與氫氧化鈉混合均勻。擴散皿放于40℃恒溫箱中保溫24 h，取出后，以0.01 mol/L的鹽酸溶液滴定至內室指示劑變至紫紅色，由滴定體積計算樣品氮含量?？瞻淄喜僮鳎?1］。

1.3.3.3 鉬銻抗比色法 抽取10 mg/L的磷標液0.00、0.25、0.50、1.00、1.50 mL，加1～2滴2，4-二 硝基酚，加2 mol/L氫氧化鈉將溶液調至淡黃色，加入2.5 mL鉬銻抗顯色劑，定容搖勻，放置40 min，于波長700 nm處比色檢測，建立磷標準曲線。y=1.9001x-0.00961（r2=0.9991）。抽取5 mL待測液于25 mL比色管，同上操作，于波長700 nm處比色檢測。

1.3.4 流動分析儀的精密度與準確性檢驗

1.3.4.1 重復性實驗 測定樣2、樣3、樣14平行消解液的全氮和全磷。測量值xi的算術平均值為樣品全氮的估計值，標準偏差（SD）用貝塞爾公式計算，相對標準偏差（RSD %）=標準偏差（SD）/計算結果算術平均值（）×100

1.3.4.2 方法回收率實驗 植物樣2、14分別稱0.0500 g，抽取1000 mg/L銨標0.5 mL，100 mg/L磷標0.5 mL，分別加入兩個樣中，按1.3.1操作重復上述實驗3次，計算回收率。即：

回收率（%）=（加標后測定值-本底值）/加標量×100

1.4 數據分析

本實驗數據采用Excel 2003軟件進行數據統計、繪圖，進行t檢驗-成對雙樣本均值分析，對傳統方法與流動分析儀測定的全氮、全磷含量進行差異顯著性分析。利用直線方程進行回歸分析，分析傳統方法與流動分析儀測定的全氮、全磷含量的相關性及顯著性。

2 結果與分析

2.1 傳統方法與流動分析儀法所測全氮、全磷的比較

本實驗選擇49個植物樣品的全氮含量在5～40 g/kg，全磷含量在0.05～6.05 g/kg。由表1可見，擴散法與流動分析儀所測氮含量平均值分別為14.09和13.88 g/kg，經t檢驗，P（T≤t）雙尾=0.29，說明以上植物樣品使用兩種方法所測全氮含量差異不顯著。鉬銻抗比色法與流動分析儀所測磷含量平均值分別為0.80和0.77 g/kg，經t檢驗，P（T≤t）雙尾=0.18，說明以上植物樣品使用兩種方法所測全磷含量差異不顯著。

表1 傳統方法與流動分析儀測定植物全氮、全磷含量的t檢驗（成對雙樣本均值分析）

2.2 傳統方法與流動分析儀所測全氮、全磷的相關性

由圖2可見，擴散法與流動分析儀測定全氮含量回歸方程Y=0.978X+0.502（r2=0.9755），兩種方法所測全氮呈極顯著性相關（P<0.01）。鉬銻抗比色法與流動分析儀測定全磷含量回歸方程Y=0.985X+0.035（r2=0.9835），兩 種 方 法 所測全磷呈極顯著性相關（P<0.01）。兩個回歸方程的斜率分別為0.978、0.985，均趨近于1，說明流動分析儀與傳統方法所測全氮、全磷含量一致。

圖2 傳統方法與流動分析儀測定植物全氮、全磷含量的相關性

2.3 流動分析儀測定全氮和全磷的準確性與精密度檢驗

采用標準加入法進行方法回收率檢驗。2個樣品的磷加標量為1 mg/L，氮加標量為10 mg/L，其消解液使用流動分析儀重復測定3次。由表2可見，流動分析儀測定全磷的平均回收率為98.67%～99.11%，全氮的平均回收率為98.23%～100.68%。說明流動分析儀同時測定全氮、全磷的準確性較高。

由表3可得，在相同檢測條件下，選擇3個植物的全磷含量在0.53～6.01 mg/L之間，全氮含量在11.86～38.21 mg/L之間。流動分析儀同時對以上3個植物的全氮、全磷含量重復測定4次，全磷含量的相對標準偏差為0.65%～5.50%，全氮含量的相對標準偏差為0.99%～3.51%?？梢?，流動分析儀同時測定全氮、全磷含量的精密度良好，測定結果穩定。

表2 流動分析儀測定植物全氮、全磷的加標回收率實驗

表3 流動分析儀測定植物全氮、全磷的重復性實驗

3 討論

本實驗植物樣品全氮含量在5～40 g/kg之間，全磷含量在0.5～6.05 g/kg之間，全氮和全磷含量高低不一，有一定代表性。本實驗提出的流動分析儀同時測定植物全氮、全磷含量方法的精密度及準確性良好，測定結果與傳統方法無顯著性差異，有良好的相關性，與傳統方法所測全氮、全磷含量有一定可比性。本實驗對現有檢測方法提出改進，進一步減少了人員工作量及試劑用量，操作簡捷高效，準確經濟。

由于大多數植物全氮、全磷含量較高，流動分析儀測定全氮、全磷含量的量程范圍在0～30 mg/L之間。為了使用流動分析儀測定植物全氮、全磷含量，現期研究多是對消解液進行高倍或多次稀釋，定容體積多在100 mL以上，以降低待測消解液全氮、全磷含量。但此做法操作繁瑣，增加純水耗用量，費工費時，且因大量的人工操作易產生差錯，不利于準確高效地檢測分析。本實驗不同于上述做法，而是將現有研究中植物常規稱量的0.2500 g調減為0.0500 g，消解液一次定容50 mL，全氮高達200 mg/L的豆科等植物消解液氮含量可控制在40 mg/L及其以下，全磷高含量植物的消解液磷含量則降至6 mg/L左右。其次是將現有研究測定全氮含量常用的管速0.32 mL/min進樣管更換為管速0.23 mL/min的進樣管，消解液進樣量減少了30%，測定全氮含量40 mg/L的樣品準確穩定，說明儀器量程擴展。張麗萍等［12］使用管速0.23 mL/min的進樣管測定植物全氮含量，檢測范圍擴展在0～50 mg/L之間，與本實驗結果一致。本實驗消解液全磷含量降至6 mg/L左右，直接以0.23 mL/min進樣管測定，與現有研究所述一致。通常情況下，一個消解液的稀釋定容包括取放容器和消解液，加水稀釋，準確定容及搖勻等一系列操作，全過程約用50 s。300個消解液的一次稀釋定容約需4.1 h，二次稀釋定容共需用8.2 h。本實驗提出的方法為一次稀釋定容至50 mL，定容體積小，操作簡捷，純水用量少，消解液稀釋定容人工操作明顯減少，由此避免了不必要的人工差錯，提高了檢測分析速度，降低了檢測成本。同時本實驗方法適用于氮含量和磷含量高低不一的植物樣品，確保流動分析儀同時測定植物全氮、全磷含量準確快速?？梢?，本實驗提出的方法具有一定應用優勢。

Bertfelot反應的適宜pH為12.8～13.3，磷鉬藍反應的適宜顯色酸度為0.35～0.55 mol/L［4，13］?，F期利用流動分析儀同時測定全氮、全磷含量的研究中，測定全氮用緩沖液的氫氧化鈉濃度為22～32 g/L，測定全磷用鉬酸銨溶液中的硫酸體積是總溶液體積的6.6%～7.1%［7，9-10，14］。本實驗所用緩沖液中氫氧化鈉濃度為19 g/L，每升鉬酸銨溶液中硫酸體積是總溶液體積的2.5%。本實驗堿化和酸化顯色液所用氫氧化鈉和硫酸量均少于現期研究。這主要因為本實驗植物消解液稀釋定容體積小，消解液保持了一定的酸度，測定全氮采用管速0.23 mL/min的進樣管，減少進樣量，堿化全氮顯色液所需的氫氧化鈉量隨之減少；而消解液本身的酸度使得鉬酸銨溶液中硫酸量無需過高即可滿足全磷含量檢測要求?，F有研究對消解液進行高倍或多次稀釋，消解液酸度下降較多，進樣管管速高，進樣量大，堿化全氮顯色液所需的氫氧化鈉量及酸化全磷顯色液所需的硫酸量均多于本實驗。Bertfelot反應和磷鉬藍反應的顯色酸堿要求截然不同，本實驗以較少的酸堿量同時滿足了兩種反應的顯色要求，說明本實驗提出的同時測定全氮、全磷含量的方法有利于節約試劑，降低成本，減少污染，且檢測準確高效，優于現期研究。

與傳統方法相比較，本實驗提出的同時測定植物全氮、全磷含量的方法測定100個植物全氮、全磷含量所用試劑量均小于250 mL，傳統方法所用高濃度氫氧化鈉達到1000 mL，其他試劑用量均在250 mL左右，所以流動分析儀的試劑量明顯少于傳統方法。此外，傳統方法測定植物全氮、全磷含量需要逐項檢測，人員工作強度大，完成100個植物全氮、全磷含量至少需要3個工作日，效率低，且人為誤差難以避免；流動分析儀同時測定100個植物全氮、全磷含量共需6 h，檢測效率是傳統方法的4倍，流動分析儀代替人工完成了抽樣、比色檢測、編輯數據報告等工作，人員工作強度小，檢測高效經濟。

4 結論

本實驗對流動分析儀同時測定植物全氮、全磷含量的方法進行了改進，避免了消解液的大量稀釋定容操作，檢測簡捷高效，經濟準確，適用植物樣品廣泛。流動分析儀測定植物全氮含量的回收率為98.23%～100.68%，相對標準偏差為0.99%～3.51%。測定植物全磷含量的回收率為98.67%～99.11%，相對標準偏差為0.65%～5.50%。該方法精密度及準確性良好，所測全氮、全磷含量與擴散法和鉬銻抗比色法無顯著性差異，且呈顯著性相關。本實驗提出的改進方法適用于批量植物全氮、全磷含量的高效檢測。