基于網絡藥理學和分子對接對當歸飲子治療特應性皮炎的作用機制研究

王子雯，許孟月，王海燕，劉學偉

1)河南中醫藥大學第一臨床醫學院 鄭州 450046 2)河南中醫藥大學第一附屬醫院皮膚科 鄭州 450000

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，在我國的發病率呈顯著上升趨勢[1-2]。其主要的臨床表現為復發性濕疹、嚴重瘙癢、脫屑和皮膚干燥等[3]。AD發病機制復雜，目前研究[4]認為，免疫失衡、皮膚屏障功能障礙、皮膚菌群紊亂是AD發病的重要環節，這些因素相互影響形成復雜的網絡，AD的治療應圍繞多因素、多靶點開展。

當歸飲子出自宋代《重訂嚴氏濟生方》，原方主治“心血凝滯，內蘊風熱，皮膚瘡疥，或腫或癢，或膿水浸淫，或發赤疹瘩瘤”，具有養血活血、祛風止癢之效，方中當歸入肝脾經，補血活血；白芍入肝脾血分，柔肝養血斂陰；川芎行氣活血祛風，補血而不滯血；生地滋陰養血；何首烏養血祛風；荊芥辛香散風，苦溫清血，須防風以散內外之風；蒺藜活血祛風止癢；黃芪、甘草健脾益氣。全方補血活血兼健脾益氣以生血，補中有行；祛風止癢又健脾實衛以固表，補中兼疏。AD的中醫證型主要包括脾虛濕蘊證、濕熱蘊結證、血虛風燥證等，其中血虛風燥證為AD慢性期的主要證型[5]。當歸飲子是治療血虛風燥型皮膚疾病的經典方劑，臨床研究[6-7]表明當歸飲子治療血虛風燥型AD可緩解患者癥狀、改善生活質量、減緩復發?，F代藥理學研究顯示，當歸飲子可影響血清IL-6、TNF-α水平，調節患者免疫功能[7]；抑制Th17細胞亞群失衡大鼠外周血IL-17、IL-23水平[8]；降低Ⅳ型過敏反應模型小鼠血清IgE水平，抑制遲發過敏反應[9]；此外，當歸飲子可抑制致敏小鼠脾淋巴細胞釋放白三烯B4[10]。綜上所述，當歸飲子具有調節免疫、抑制過敏及炎癥反應的作用，但當歸飲子治療AD的具體作用機制尚不明確。網絡藥理學具有系統性、整體性的特點，為觀察中藥復方多成分、多靶點、多途徑干預和影響疾病網絡提供了重要支撐。本研究基于中藥網絡藥理學和分子對接，探討當歸飲子治療AD的作用機制，以期為后續的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1當歸飲子活性成分的篩選在中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集當歸、白芍、川芎、荊芥、防風、黃芪、蒺藜、甘草的全部化學成分，同時在化學專業數據庫(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp)及文獻資料中收集生地黃、何首烏(制)的化學成分，以口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18為條件進行活性成分篩選。

1.2當歸飲子活性成分靶點與AD疾病靶點的預測使用TCMSP數據庫預測當歸飲子活性成分的靶點，并利用Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)得到靶點的標準基因名，刪除無對應基因名的靶點。以“atopic dermatitis”為檢索詞在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)、DisGeNET數據庫(http://disgenet.org)、TTD數據庫(http://db.idrblab.net/ttd/)進行檢索，得到AD疾病靶點。

1.3活性成分-靶點-疾病網絡的構建將活性成分靶點與疾病靶點導入Venny2.1.0在線平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，獲得活性成分-疾病共同靶點并繪制韋恩圖。通過Cytoscape 3.7.2軟件構建活性成分-靶點-疾病網絡?！肮濣c”代表當歸飲子活性成分、疾病、靶點,“邊”代表不同節點之間的相互關系。根據拓撲分析中節點的度(Degree)值和介數中心性的大小確定當歸飲子中的關鍵活性成分。

1.4蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建將篩選的活性成分-疾病共同靶點輸入STRING平臺(https://string-db.org)構建靶點互作網絡圖，設定蛋白種屬為“Homo sapiens”，篩選條件最低相互作用閾值為highest confidence，將結果保存為tsv格式，導入Cytoscape 3.7.2并利用Network Analyzer、Generate style from statistics工具進行網絡分析，繪制PPI網絡圖，并依據大于Degree值的2倍篩選核心靶點。

1.5核心靶點生物功能分析注釋利用R 3.6.2 clusterProfiler包對核心靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.6分子對接從PDB(https://www.rcsb.org/)、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫下載活性成分與靶點的3D結構，并利用openbabel軟件轉換為pdb格式備用。將蛋白分子及配體分子的pdb文件導入AutoDock tolls 1.5.6處理并保存為pdbqt格式文件。運行AutoDock Vina軟件，把處理好的活性化合物與靶蛋白進行對接，并運用Discovery Studio 2020軟件繪圖。

2 結果

2.1當歸飲子活性成分經過篩選，共得到184個有效成分，其中當歸2個、生地黃6個、白芍13個、川芎7個、荊芥11個、防風18個、黃芪20個、蒺藜12個、何首烏(制)3個、甘草92個，去除重復值，共得到157個活性成分。

2.2當歸飲子活性成分靶點與AD疾病靶點在TCMSP數據庫進行靶點預測后通過Uniprot數據庫進行標準化，刪除51個無對應基因名的靶點，最后得到232個活性成分靶點。以“atopic dermatitis”為檢索詞在GeneCards、DisGeNET、TTD數據庫分別得到了53、752、1 495個與AD相關的基因，去除重復后得到1 779個疾病靶點。

2.3活性成分-靶點-疾病網絡將232個活性成分靶點與1 779個疾病靶點輸入Venny2.1.0中，得到129個共同靶點。利用Cytoscape 3.7.2構建活性成分-靶點-疾病網絡圖。網絡拓撲學分析節點平均Degree值為9.939 849，節點平均介數中心性為0.002 679，大于平均度Degree值與平均介數中心性的節點共13個，為當歸飲子的關鍵活性成分，見表1。

表1 當歸飲子的關鍵活性成分

2.4PPI網絡構建與核心靶點的篩選經分析，初步獲得一個113個節點、572條邊的PPI網絡圖，經二次篩選,得到12個節點、52條邊的PPI網絡圖，這12個節點即為核心靶點，見圖1和表2。

STAT3：信號轉導和轉錄活化因子3；MAPK：絲裂原活化蛋白激酶；AKT：蛋白激酶B

表2 當歸飲子PPI網絡中的核心靶點的Degree值

2.5GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結果選取GO功能富集分析前20(表3)做條形圖。由結果可知富集最多的有6個，主要涉及MAPK、AKT活性和RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合等。

表3 GO富集分析結果前20條目

選取KEGG通路富集分析排名前20(表4)做氣泡圖，篩選出通路92條，其中富集最多的有10個，與當歸飲子治療AD密切相關的通路主要包括Toll樣受體、TNF、 IL-17、Th17、Th1/Th2細胞分化信號通路等。

表4 KEGG富集分析結果前20條目

2.6分子對接結果選取Degree值排名前3的關鍵活性成分與PPI網絡中排名前6的核心靶點進行分子對接。將每組結合能最低的分子對接結果進行展示，發現P65與山柰酚的結合能力最強。當歸飲子成分與靶標的結合親和力均小于-5 kcal/mol，說明篩選的核心靶點與其對應的活性成分具有良好的親和力。MAPK1與木樨草素分別在ASP111、CYS166、LYS54處形成氫鍵；TNF與木樨草素分別在TYR151、GLN61處形成氫鍵；JUN與木樨草素分別在ASN156、MET111、ASN119處形成氫鍵；P65與山柰酚TYR285、HIS252處形成氫鍵；STAT3與木樨草素分別在GLU360、MET99處形成氫鍵；MAPK3與木樨草素分別在GLU360、MET99處形成氫鍵GLU50、ASP123、MET125形成氫鍵。

3 討論

目前有關當歸飲子治療AD的研究主要圍繞臨床觀察，具體的作用機制亟待進一步深入探討。本研究通過對當歸飲子治療AD的活性成分-靶點-疾病網絡圖拓撲學分析，發現當歸飲子治療AD的13個關鍵活性成分，包括槲皮素、木樨草素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、刺芒柄花素等。其中槲皮素、山柰酚、木樨草素、柚皮素、甘草查爾酮A均為黃酮類化合物，具有抗炎、調節免疫、抗菌、抗氧化等多種作用[11]。槲皮素可以調節Th1/Th2穩定性，并減少B細胞釋放抗原特異性IgE抗體[12]。木樨草素可降低血清IgE和IL-4水平，阻止表皮水分流失，發揮止癢與抗AD的作用[13]。山柰酚可通過抑制NF-κB、PI3K/Akt、MAPK、janus激酶等信號通路，調節炎癥相關基因的表達，對各種急慢性炎癥性疾病起到治療作用[14]。漢黃芩素可抑制炎癥相關的酶，如環氧合酶(COX)的活性，調節炎癥相關蛋白的表達，治療皮膚炎癥性疾病[15]，還可平衡Th1/Th2細胞因子，抑制肥大細胞釋放組胺而治療過敏性疾病[16]。柚皮素可抑制CD4+T細胞活化和血清IgE、IFN-γ水平，減少嗜酸性粒細胞浸潤，減輕AD樣皮損[17]。刺芒柄花素可抑制上皮衍生的TSLP、IL-33等細胞因子，減輕過敏性疾病[18]。這些成分均具有抗炎、調節免疫的作用，可能是當歸飲子治療AD的主要物質基礎。

PPI網絡分析結果顯示核心靶點包括STAT3、P65、MAPK1、MAPK3、TNF、IL-6等。STAT3屬于信號轉導及轉錄激活蛋白家族，參與炎癥、免疫、細胞增殖、分化、凋亡等過程，可通過調節Th2細胞分化、加強皮膚屏障功能及刺激各種趨化因子、炎性因子分泌等影響AD疾病的進程[19]。P65屬于NF-κB家族，廣泛存在于多種生物學過程中，通常處于非活性狀態，可由多種刺激激活后轉移至細胞核，調節炎癥因子的表達。STAT3和NF-κB是調節炎癥反應的關鍵轉錄因子，可激活炎癥因子，如COX-2、TNF-α、IL-6等[20]。有研究[21]發現與健康皮膚相比，AD上皮細胞核中的P65水平升高。MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14、細胞外信號調節激酶(ERK)屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，是MAP激酶信號轉導途徑的重要組成部分，可被多種細胞外刺激激活而在炎癥的發生發展中發揮重要作用。Ryu等[22]發現在IL-33處理的角質形成細胞中緊密連接蛋白Claudin-1(CLDN1)表達下調，且受到ERK、STAT3的調節。TNF可刺激免疫細胞分泌多種炎癥因子，促進局部炎癥反應。最近研究[23]發現TNF超家族的TWEAK可通過誘導Fn14參與AD炎癥反應和角質形成細胞凋亡。IL-6參與免疫、炎癥、感染、組織重塑等多種過程。研究[24]發現IL-6與其配體結合后可激活JAK-STAT3信號通路，調節Th17細胞功能，影響慢性炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發生。上述的靶點可能通過調節免疫細胞、炎癥因子等多種途徑影響AD的發病，有望成為當歸飲子治療AD的重要靶點。

KEGG通路富集分析Degree值排名前20且靶向AD的通路主要涉及IL-17、Th17、Toll樣受體、Th1/Th2細胞分化信號通路等，這些信號通路與炎癥免疫應答密切相關。AD發病機制復雜，涉及遺傳、環境、免疫紊亂、皮膚屏障受損、皮膚菌群失調等，多種T細胞免疫平衡失調導致的細胞因子分泌異常是AD發病的重要機制，其中Th2免疫反應在急性期AD中發揮著主導作用[25]，慢性病變中，Th1、Th22、Th17的免疫反應增強[26]，尤其在亞裔患者中顯示出更多的Th17免疫激活。IL-17信號通路激活可誘導NF-κB、MAPK等下游基因的表達[27]；研究[28]發現IL-17可調節Th2細胞免疫反應，增加 IL-4及IgE的產生，刺激IL-8、TNF-α、TSLP、CXL17、CXCL10等炎癥因子的產生，抑制患者皮膚絲聚蛋白表達，加劇皮膚屏障缺陷，導致慢性特應性皮炎的發展[29]。此外，AD患者外周血中Th17、IL-17細胞的表達較正常人升高[30]，并在AD發病中起到重要作用。Toll樣受體信號通路可產生多種細胞因子及抗生物肽等，在皮膚免疫防御系統中發揮重要作用。Toll樣受體2遺傳多態性可影響AD病情的發展，Toll樣受體2信號轉導異常會降低皮膚緊密連接蛋白與抗菌肽水平，導致AD皮膚屏障缺陷，還可能導致AD免疫系統失衡[31-32]?？傊?，AD的發病與上述通路密切相關。本研究的富集分析結果表明當歸飲子活性成分的作用靶點也與上述通路相關。本研究的分子對接結果顯示，當歸飲子治療AD的主要活性成分槲皮素、木樨草素、山柰酚與PPI網絡中核心靶點STAT3、JUN、TNF、MAPK1、MAPK3、P65均有良好的親和力，提示其在治療過程可能起關鍵作用。

總之，當歸飲子治療AD的主要活性成分可能為槲皮素、木樨草素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素等，這些活性成分通過作用于STAT3、P65、MAPK、TNF、IL-6、IL-17、Toll樣受體、Th17等靶點和信號通路發揮對AD的干預作用。本研究僅依靠網絡藥理學方法對當歸飲子治療AD的潛在作用機制進行了初步探討，仍需進一步基礎實驗及臨床實驗研究的觀察與佐證。