單純皰疹病毒腦炎患者糞便和血清中炎癥相關指標的變化

付 雨，王新新，劉 晗，項舒雅，王雪晶,丁雪冰

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

單純皰疹病毒腦炎(herpes simplex virus encephalitis，HSE)是由單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)感染引起的一種急性中樞神經系統(central nervous system，CNS)感染性疾病，是CNS最常見的病毒感染性疾病[1]，全球發病率為0.02‰～0.04‰[2]。該病病死率及致殘率較高，且后遺癥較多，預后較差[3]。近年來，腸道炎癥與中樞神經系統疾病的關系被廣泛認知[4]。有研究[5]證實腸道炎癥可通過腸-腦軸激活小膠質細胞，促進其分泌炎癥因子，進而增加血腦屏障(bood-brain barrier，BBB)通透性，加重BBB功能障礙。但目前，HSE患者腸道炎癥改變尚不明確，且評估其預后的方式有限。本研究通過ELLSA法測定了HSE患者糞便中炎癥相關指標[糞鈣衛蛋白(fecal calprotectin,FC)、糞α-1-抗胰蛋白酶(fecal alpha-1-antitrypsin,FAT)、糞連蛋白(fecal zonulin,FZ)、糞乳鐵蛋白(fecal lactoferrin,FLF)]及血清中炎癥相關指標[脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、脂多糖結合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)]的水平，并對部分HSE患者進行腸黏膜活檢，評估腸道炎癥在HSE中的作用，探索HSE潛在的治療策略。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2018年9月至2020年5月鄭州大學第一附屬醫院神經內科收治的65例由兩位神經科專家根據臨床表現及各項輔助檢查確診的HSE患者。研究納入標準：①有典型HSE臨床表現且腦脊液單純皰疹病毒抗體陽性。②同意配合糞便樣本及血液樣本檢測，并簽署知情同意書。③在發作的急性期采集糞便及血液標本。排除標準：①近3個月內曾使用抗病毒、抗菌類藥物、益生菌類藥物、激素類藥物等。②既往有胃腸道疾病史、內分泌系統疾病史、肝臟疾病史、心腦血管疾病史、重金屬中毒史等[6]。65例中男33例，女32例，年齡26～49(40.6±15.4)歲。根據入院時改良Ranking量表(mRS)評分將HSE患者分為輕度神經功能障礙組(A組，mRS評分為1或2分，n=11)、中度神經功能障礙組(B組，mRS評分為3或4分，n=15)和嚴重神經功能障礙組(C組，mRS評分為5分，n=39)。選取同期65名健康對照者，均自愿參與本研究，且均為患者直系親屬、配偶或處于共同生活環境者，其中男32例，女33例，年齡28～52(49.5±11.8)歲。各組在性別、年齡、體重、職業、既往史等方面均衡，組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2分析指標

1.2.1 臨床特征 收集研究對象的臨床信息，包括姓名、性別、年齡、體重、職業、既往史、入院時mRS評分。

1.2.2 糞便及血液標本的收集及檢驗 收集HSE患者急性發作期(治療前)糞便標本(1 g)，加入9 g中性磷酸鹽緩沖液(Life Technologies公司)，用勻漿器充分勻漿，3 000 r/min離心10 min后取上清液，分裝并置于-80 ℃冰箱待檢，于2 h內送檢。收集HSE患者急性發作期(治療前)肘部靜脈血10 mL，3 000 r/min離心10 min后取上清液，分裝并置于-80 ℃冰箱待檢，于2 h內送檢。健康對照者留取晨起首次糞便標本及靜脈血，處理同上。糞便中FC、FAT、FZ、FLF和血清中LPS、LBP水平均采用ELLSA法檢測，試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司及南京建成生物工程研究所。實驗操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 電子結腸鏡及腸黏膜組織病理學分析 A、B、C 3組各有2例及5名健康對照者接受電子結腸鏡及腸黏膜組織病理學檢查，并簽署相關知情同意書。電子結腸鏡檢查由同一位內鏡醫師完成。檢查前清潔腸道，檢查中取2～3塊黏膜粗糙處組織，首先將組織固定于體積分數4%甲醛溶液中，常規脫水、石蠟包埋、4 μm厚切片、常規HE染色，普通顯微鏡下觀察。

1.3統計學處理采用SPSS 26.0對數據進行分析。應用兩獨立樣本t檢驗比較HSE組與健康對照組LPS、LBP、FC、FAT、FZ和FLF水平的差異，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較3組HSE患者LPS、LBP、FC、FAT、FZ、FLF水平的差異。應用Pearson分析HSE患者血清LPS、LBP與糞便FC、FAT、FZ、FLF之間的相關性。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1HSE組與健康對照組LPS、LBP、FC、FAT、FZ和FLF水平比較見表1。

表1 HSE組與健康對照組LPS、LBP、FC、FAT、FZ和FLF水平比較

2.2A、B、C3組HSE患者LPS、LBP、FC、FAT、FZ、FLF水平比較見表2。

表2 A、B、C 3組HSE患者LPS、LBP、FC、FAT、FZ、FLF水平比較

2.3HSE患者血清LPS、LBP水平與糞便FC、FAT、FZ、FLF水平之間的相關性分析見表3。

表3 HSE患者血清LPS、LBP水平與糞便FC、FAT、FZ、FLF水平之間的相關性分析

2.4腸黏膜組織病理學結果6例HSE患者腸黏膜均顯示出不同程度的黏膜慢性炎癥，間質伴有不同程度的淋巴細胞、漿細胞及中性粒細胞浸潤，腺體輕度反應性增生，少許腺體破壞、變形；5例健康對照者腸道黏膜組織病理學未見明顯異常。見圖1。

A：C組HSE患者；B：健康對照者

3 討論

近年來，隨著腸-腦軸的發現[7]，腸道炎癥被證實與多種中樞神經系統疾病相關[8-9]。HSE是全球散發性壞死性腦炎最常見的疾病之一，其發病原因與HSV感染相關[10]。HSV優先潛伏在周圍神經節，各種刺激均可誘發病毒的激活，但病毒進入CNS的具體機制尚不明確，目前普遍被接受的病毒入侵途徑包括神經軸突運輸和血行播散等[11]，而腸道炎癥反應可能是病毒入腦的環境因素之一。

腸道與神經元之間存在復雜的相互關系，兩者可通過免疫反應、細胞因子及激素的釋放等方式形成雙向信號傳遞[12-14]。既往研究[15-16]認為腸道炎癥反應時腸黏膜通透性的增加可引起腸道菌群移位，間接引起CNS先天性和適應性免疫應答反應，導致腦組織損傷。一些菌群代謝產物如短鏈脂肪酸也可直接穿過BBB影響大腦功能。此外，腸道固有層中存在大量γδ T細胞，這些細胞在腸道炎癥反應時可分泌IL-17等炎癥因子，加重腦組織損傷[17]，與此同時還可能引發肺炎、敗血癥等感染性疾病。相反，CNS的損傷對腸道亦有一定的影響，比如通過激活腸道免疫反應，引起肥大細胞釋放組胺等炎癥介質，促進腸黏膜上皮細胞的凋亡及杯狀細胞的減少等一系列反應，最終使腸黏膜通透性增加，從而形成惡性循環[18]。

腸道炎癥反應可促進LPS的分泌及移位，LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，是一種內毒素，在LBP作用下與靶細胞受體結合產生一系列反應[19]。LPS可激活酪氨酸激酶家族EphrinA1/EphA2信號轉導通路，降低腸緊密連接蛋白Zoccludin和ZO-1的表達，導致腸屏障功能受損，進而加重腸道炎癥反應[20-21]。LPS也具有一定的神經毒性，在腦微血管內皮細胞中存在的LPS跨膜受體——Toll樣受體，可將LPS的刺激信號向細胞內傳遞，導致內皮細胞損傷，進而增加BBB通透性，誘發腦水腫，加重CNS炎癥反應[22]。BBB通透性增加后可促進神經毒素及病原體微生物入腦，進一步推動HSE的發病及病情進展。除此之外， LPS可刺激白細胞和內皮細胞產生促炎因子，如白介素、TNF-α、前列腺素等，引發炎癥級聯反應，加重全身感染，最終導致休克或死亡[23-25]。

目前，大量文獻[9,26-27]報道腸道炎癥在中樞神經系統疾病中起到某種促進作用：一方面腸道炎癥反應可激活腸-腦軸，最終導致BBB通透性增高和功能障礙，加速病毒及炎性因子入腦；另一方面，腸道炎癥間接促進血清LPS和LBP的分泌，進一步促進全身炎癥反應的發生，甚至形成全身級聯炎癥反應，加快疾病的進展。FC、FAT和FZ是反映腸道炎癥及腸黏膜通透性的重要指標，且其水平與腸道炎癥嚴重程度呈正相關。本研究結果顯示，6例HSE患者腸黏膜活檢均顯示不同程度的炎癥反應，HSE患者糞便中腸道炎癥指標水平增高，且嚴重神經功能障礙組>中度神經功能障礙組，中度神經功能障礙組>輕度神經功能障礙組。表明腸道炎癥可能參與了HSE的發病及病情進展，且腸道炎癥嚴重程度可間接預警HSE患者的病情嚴重程度，但具體機制仍需大量研究證實。

綜上所述，腸道炎癥與HSE相關，動態監測糞便FC、FAT和FZ及血清LPS、LBP的變化可能對HSE患者病情評估起到一定預警作用。而減輕腸道炎癥反應可能成為改善HSE患者病情的新的切入點。本研究的不足之處在于研究樣本量較小，故腸道炎癥反應在HSE發病及病情進展中的作用有待擴大樣本量進一步研究證實。