3,22-二羥基何伯烷的單晶結構及波譜學數據

姜 壘，付 陽，郭文文，鄭 果，王 強,*

1. 河南省科學院高新技術研究中心，河南 鄭州 450002；2. 河南省生殖健康科學技術研究院，河南 鄭州 450002

引 言

何伯烷型三萜，例如3α,22-二羥基何伯烷（化合物1）、3β,22-二羥基何伯烷（化合物2）、3-氧代-22-羥基何伯烷（化合物 3），以及 3β,22-二羥基-21α-H-何伯烷（化合物 4）（圖 1）[1-6]等，是一類重要的天然產物，廣泛分布于各種植物的葉和莖皮中.其中，化合物1和化合物2可以通過還原化合物 3得到[1,7]，兩者的絕對構型通?；诨瘜W反應[2,4-6]或關鍵的核磁共振（NMR）數據，包括1H NMR和/或13C NMR數據來判定[2,3].然而，文獻[2,3,8]報道的NMR數據并不完整.

圖1 四種天然何伯烷型五環三萜的結構Fig. 1 The structures of four hopane natural products

本文在制備得到純的化合物1和化合物2的基礎上，利用X-射線單晶衍射（XRD）實驗測得了化合物2的絕對構型，并完整歸屬了這兩個化合物的1H NMR和13C NMR數據.

1 實驗部分

1.1 化合物制備

起始原料化合物3從達瑪樹脂（Damar resin）中分離得到.根據文獻[4]方法，化合物3溶于甲醇和二氧六環的混合溶劑，NaBH4作為還原劑，加熱回流還原化合物3，得到的主產物為β-異構體（化合物2）.然而，與文獻[8]所述不同的是，快速柱色譜并不能分離純化這兩個異構體（化合物1和化合物2）.此外，無論用甲醇做溶劑、NaBH4為還原試劑，還是四氫呋喃作溶劑、三異丁基硼氫化鋰（L-selectride）為還原試劑，均不能得到單一構型化合物，兩種方法得到的化合物1和化合物2的摩爾比分別為1:9和6:4（利用1H NMR譜圖計算）.鑒于兩種異構體均需要進行1H和13C NMR歸屬，我們選擇三異丁基硼氫化鋰作為還原試劑來獲得純的化合物1和化合物2.

化合物1和化合物2的制備如圖2所示.將化合物3（221 mg，0.5 mmol）溶于2,6-二甲基吡啶（2,6-Lutidine，10 mL），冰浴下加入三乙基硅基三氟甲磺酸酯（TESOTf）2.6 mL（2.6 mmol），滴加完畢后室溫攪拌3 h，經薄層色譜（TLC）檢測反應完畢后，加水、乙酸乙酯萃取，硅膠柱分離得到化合物5（3-氧代-22-三乙基硅基何伯烷）（268 mg，96.2%）.將化合物5（200 mg，0.36 mmol）溶于無水二氯甲烷（10 mL），-78 ℃加入三異丁基硼氫化鋰2.0 mL（1.0 mol/L四氫呋喃溶液），低溫下繼續攪拌4 h，反應完畢后加水，二氯甲烷萃取，硅膠柱分離得到化合物6a（114 mg，56.6%）和6b（76 mg，37.8%）.稱取化合物 6a（3α-羥基-22-三乙基硅基何伯烷）和6b（3β-羥基-22-三乙基硅基何伯烷）各56 mg（0.1 mmol）分別溶于10 mL四氫呋喃，室溫下各加入四丁基氟化銨（TBAF）1 mL（1.0 mol/L四氫呋喃溶液），繼續攪拌6 h，反應完畢后蒸干溶劑，加水和二氯甲烷萃取，硅膠柱色譜分離得到化合物1（39 mg，87.7%）和化合物2（40 mg，89.9%）.

圖2 化合物1和化合物2的合成路線Fig. 2 Synthesis of compound 1 and compound 2

上述方法也成功用于白樺脂酸衍生物[9]和核苷類化合物[10]α-、β-異構體的分離，表明該方法適用于極性相似的α-、β-異構體的分離純化.

1.2 XRD實驗

為了確認化合物1和化合物2的絕對構型，以便正確歸屬兩個化合物的1H和13C NMR數據，以二氯甲烷和甲醇作為結晶溶劑，得到了化合物2的無色、塊狀單晶（多次實驗未能得到化合物1的單晶）.選擇0.20×0.18×0.15 mm3大小的晶體，在Agilent SuperNova Diffraction單晶衍射儀上，采用經石墨單色化的Cu Kα射線（λ=1.541 78 ?）進行測量，各衍射數據在293 K下收集.

1.3 NMR實驗

樣品溶于氘代吡啶（pyridine-d5），并以吡啶作為內標定標（δH7.22，δC123.9）.1D和2D NMR實驗均在配備OneNMR Probe探頭的Agilent 400-MR型NMR譜儀上完成.1H NMR和13C NMR的工作頻率分別為399.79 MHz和100.54 MHz，譜寬分別為4 006.4 Hz和25 000 Hz.2D譜包括NOESY和2D梯度場1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC譜，均采用標準脈沖程序.1H-1H COSY的F2（1H）和F1（1H）維譜寬均為 4 006.4 Hz，采樣數據點陣t2×t1=1 024×256，累加次數為 8；NOESY的F2（1H）和F1（1H）維譜寬均為2 800 Hz，采樣數據點陣t2×t1=1 024×256，累加次數為16；HSQC的F2（1H）和F1（13C）維譜寬分別為6 410 Hz和20 100 Hz，采樣數據點陣t2×t1=1 024×256，累加次數為16；HMBC的F2（1H）和F1（13C）維譜寬分別為3 788 Hz和16 084 Hz，采樣數據點陣t2×t1=1 024×512，累加次數為32.

2 結果與討論

2.1 化合物2的單晶衍射數據分析

通過XRD實驗進一步證實了3β,22-二羥基何伯烷（化合物2）的立體化學結構，化合物2的透視圖如圖3所示.該化合物的晶體學數據作為補充出版物（CCDC1868374）保存于劍橋晶體數據中心（Cambridge Crystallographic Data Centre，12 Union Road，Cambridge CB2 1EZ，UK），可以免費申請數據副本（E-mail: deposit@ccdc.cam.ac.uk）.表1中列出了化合物 2的晶體數據和細節信息.XRD分析顯示化合物 2的晶體為單斜晶系，空間群為C2.四個六元碳環（A、B、C、D）均為椅式構象，而五元碳環（E）中C17、C19、C20和C21形成一個平面（平均偏差為0.029 6°），為信封式構象.O1-C3和O2-C22的鍵長分別為1.452(5) ?和1.542(7) ?（1 ?=0.1 nm）.

圖3 化合物2的單晶結構Fig. 3 The single-crystal structure of compound 2

表1 化合物2的單晶數據Table 1 Crystallographic data and structure refinement details of compound 2

2.2 NMR譜圖分析

2.2.1 化合物2的歸屬

化合物2的1H NMR（圖S1，可掃描文章首頁OSID碼或在文章網頁版查看）譜中能夠直接清晰辨認的有 8個甲基和δH0.82（1H，dd，J=11.4/1.9 Hz）、δH2.24（1H，ddt，J=13.1/4.7/2.4 Hz）、δH2.42（1H，dt，J=11.9/9.0 Hz）、δH3.49（1H，dt，J=10.3/5.6 Hz）、δH4.94（1H，s）、δH5.75（1H，d，J=5.3 Hz）等六個質子.HSQC譜（圖S2）顯示δH4.94（1H，s）和δH5.75（1H，d，J=5.3 Hz）這兩處質子為活潑氫（無相關信號），根據化學位移，結合1H-1H COSY（圖S3）可歸屬δH3.49（1H，dt，J=10.3/5.6 Hz）為 H-3，δH5.75（1H，d，J=5.3 Hz）為 3-OH，δH4.94（1H，s）為 22-OH，結合HSQC譜歸屬δC78.5（叔）為C-3.13C NMR譜（圖S4）中顯示化合物2有30個碳原子，DEPT譜（圖S5）表明化合物2有8個伯碳、10個仲碳、6個叔碳和6個季碳.HMBC（圖4）譜中，H-3和δC16.8（伯）、δC29.2（伯）、δC39.9（季），3-OH和C-3、δC28.8（仲）、δC39.9（季），22-OH和δC30.3（伯）、δC31.9（伯）、δC52.0（叔）、δC72.9（季）遠程偶合相關，可準確歸屬C2 [δC28.8（仲）]、C4 [δC39.9（季）]、C21 [δC52.0（叔）]、C22 [δC72.9（季）]；借助 HSQC 譜，以及 H-3和 H-23 之間的 NOE 效應（圖 S6），H-2 [δH1.89（2H，m）]、H-21 [δH2.42（1H，dt，J=11.1/9.0 Hz）]、H-23 [δH1.28（3H，s）]、H-24 [δH1.08（3H，s）]、C-23 [δC29.2（伯）]、C-24 [δC16.8（伯）]也得到準確歸屬.借助于HMBC譜中與C-23和C-24的遠程偶合相關信號，將1H NMR譜中最高場的質子δH0.82（1H，dd，J=11.4/1.9 Hz）歸屬為 H-5，結合 HSQC 譜可指認出 C-5 [δC56.1（叔）].HMBC譜顯示，δC16.6（伯）和H-5遠程偶合相關，歸屬為C-25，借由HSQC譜圖可知δH0.90（3H，s）為 H-25.接下來，借助于 HMBC 譜中 H-25 與 C-1 [δC39.6（仲）]、C-9 [δC51.1（叔）]、C-10 [δC37.8（季）]的遠程偶合相關信號峰，可以準確歸屬C-1、C-9和C-10；通過HSQC譜中相關信號，可分別歸屬 H-1 [δH1.71（1H，dt，J=13.0/3.5 Hz）、δH0.99（1H，m）]和 H-9 [δH1.30（1H，m）].A環的所有碳原子和質子信號得到歸屬.

通過 HMBC 譜中 H-21 與 C-17 [δC55.1（叔）]、C-18 [δC44.8（季）]、C-20 [δC27.4（仲）]的遠程偶合相關，結合HSQC譜，C-17、C-18、C-20以及H-17 [δH1.53（1H，m）]和H-20 [δH1.85（1H，m）、δH1.78（1H，m）]得到相應歸屬.基于HMBC譜中δH0.97（3H，s）與C-17和C-18的遠程相關信號，將其歸屬為H-28，C-28 [δC17.0（伯）]可通過HSQC譜圖準確指認.借助于HMBC譜中與 H-28 相關的 C-13 [δC50.6（叔）]和 C-19 [δC42.2（仲）]，結合 HSQC 譜，可歸屬 C-13、C-19、H-13 [δH1.46（1H，m）]和 H-19 [δH1.62（1H，m）、δH1.03（1H，m）].E 環的所有碳原子和質子信號得到歸屬.

HMBC譜中，δH2.24（1H，ddt，J=13.1，4.7，2.4 Hz）與C-18和δC42.6（季）遠程偶合相關，HSQC譜中，該質子和δH1.84（1H，m）與δC22.8（仲）相關，NOESY譜中，δH2.24（1H，ddt，J=13.1，4.7，2.4 Hz）與 H-29和H-30相關，歸屬δH2.24（1H，ddt，J=13.1/4.7/2.4 Hz）和1.84（1H，m）為 H-16，δC22.8（仲）為 C-16，δC42.6（季）為 C-14.HMBC譜中，δH1.02（3H，s）與 C-13、C-14、δC35.2（仲）和δC42.4（季）遠程偶合相關，歸屬δH1.02（3H，s）為H-27，δC35.2（仲）為 C-15，δC42.4（季）為 C-8.結合 HSQC 譜，可準確歸屬 C-27 [δC17.7（伯）]、H-15 [δH1.43（1H，m）、δH1.29（1H，m）].D環歸屬完畢.

圖4 化合物2的HMBC譜Fig. 4 HMBC spectrum of compound 2

HMBC譜中，δH1.01（3H，s）和C-8、C-9、C-14及δC34.1（仲）遠程偶合相關，歸屬δH1.01（3H，s）為H-26，δC34.1（仲）為 C-7，結合HSQC 譜可準確歸屬C-26 [δC17.3（伯）]和H-7 [δH1.46（1H，m）、δH1.23（1H，m）].HMBC譜中顯示H-5和C-4、C-7、C-9、C-10、C-23、C-24、C-25及δC19.3(仲)遠程偶合相關，歸屬δC19.3（仲）為C-6，結合HSQC可歸屬H-6 [δH1.61（1H，m）、δH1.46（1H，m）]，B環歸屬完畢.至此，僅余δH1.54（1H，m）、δH1.30（1H，m）、δC21.8（仲）和δH1.47（2H，m）、δC24.9（仲）未歸屬.借助于NOESY譜中δH1.30（1H，m）與H-25的相關信號，結合HSQC歸屬δH1.54（1H，m）和δH1.30（1H，m）為H-11，δC21.8（仲）為C-11，則δH1.47（2H，m）為H-12，δC24.9（仲）為C-12.至此，所有數據歸屬完畢. 值得注意的是，H-29和H-30均與H-16、H-21這兩組質子有NOE效應，表明C21-C22鍵在溶液中可以自由旋轉，亦即H-29和H-30的化學位移可以互換.同樣由于C21-C22鍵可以自由旋轉，亦無法通過C-H遠程偶合來準確歸屬C-29和C-30.HMBC和NOESY譜中的主要相關信號如圖5所示.

化合物2的所有1H NMR和13C NMR數據如表2所示.

圖5 化合物2中主要的1H-13C遠程偶合相關(→)和1H-1H NOE相關(?)Fig. 5 Selected key 1H-13C heteronuclear multiple-bond connectivity (→) and 1H-1H NOESY correlations (?) of compound 2

表2 化合物2的1H和13C NMR實驗數據（溶劑：Pyridine-d5）和文獻數據（溶劑：CDCl3）Table 2 1H and 13C NMR experimental data (Solvent: Pyridine-d5) and documentary data (Solvent: CDCl3)of compounds 2

續表2Continuation of the Table 2

2.2.2 化合物1的歸屬

化合物1的1H NMR譜（圖S7）中能夠直接辨認的信號有8個甲基，δH2.05（1H，m）、δH2.21（1H，ddt，J=12.9/4.5/2.4 Hz）、δH2.40（1H，dt，J=11.1/8.9 Hz）和δH3.65（1H，t，J=2.8 Hz），根據化學位移可歸屬δH3.65（1H，t，J=2.8 Hz）為H-3，但1H NMR譜中未見到3-OH和22-OH的信號，應與δH4.95處的水峰重疊導致無法辨認.13C NMR譜（圖S8）顯示化合物有30個碳，DEPT譜（圖S9）表明化合物2有8個伯碳，10個仲碳，6個叔碳和6個季碳.1H-1H COSY譜（圖S10）中，H-3和δH2.05（1H，m）、δH1.81（1H，m）偶合相關，歸屬δH2.05（1H，m）和δH1.81（1H，m）為H-2，結合HSQC譜（圖S11）歸屬δH75.7（叔）和δH27.0（仲）為C-3和C-2.由HMBC譜圖（圖6）可知，H-3和δC23.0（伯）、δC34.3（仲）、δC49.5（叔）遠程偶合相關，結合HSQC譜圖，C-1[δC34.3（仲）]、C-5 [δC49.5（叔）]和H-1、H-5得到歸屬.在HMBC譜中，H-5與δC16.5（伯）、19.1（仲）、23.0（伯）、29.8（伯）、34.1（仲）、38.0（季）、38.5（季）、50.9（叔）遠程偶合相關，δH1.25（3H，s）與δC23.0（伯）、38.5（季）、C-5、C-3遠程偶合相關，δH0.94（3H，s）和δC29.8（伯）、38.5（季）、C-5、C-3遠程偶合相關，H-2和δC38.0（季）遠程偶合相關，NOESY譜（圖S12）中，H-2和δH0.93（3H，s）、δH0.94（3H，s）有相關信號，根據上述信息，H-25 [δH0.93（3H，s）]、H-24 [δH0.94（3H，s）]、H-23 [δH1.25（3H，s）]、C-25 [δC16.5（伯）]、C-24 [δC23.0（伯）]、C-23 [δC29.8（伯）]、C-10 [δC38.0（季）]、C-4[δC38.5（季）]、C-9 [δC50.9（叔）]得到準確歸屬，結合HSQC可準確歸屬H-9 [δH1.47（1H，m）].至此，A環的所有碳原子和質子信號歸屬完畢.

圖6 化合物1的HMBC譜Fig. 6 HMBC spectrum of compound 1

13C NMR譜中，C-3和δC72.7（季）處于最低場，歸屬δC72.7（季）為C-22.HMBC譜中，δH2.40（1H，dt，J=11.1/8.9 Hz）與C-22遠程偶合相關，結合HSQC譜，可將δH2.40（1H，dt，J=11.1/8.9 Hz）和δC52.0（叔）歸屬為H-21和C-21.而借助于H-21和δC27.4（仲）、δC44.8（季）、δC55.1（叔）在HMBC譜中的遠程偶合相關信號，H-21與δH1.53（1H，m）、δH1.69-1.89（2H，m）在1H-1H COSY譜中的偶合相關信號，以及HSQC譜圖，可歸屬C-17 [δC55.1（叔）]、C-18 [δC44.8（季）]、C-20[δC27.4（仲）]、H-17 [δH1.53（1H，m）]和 H-20 [δH1.83（1H，m），δH1.78（1H，m）].此外，HMBC譜顯示，H-21還與δC30.3（伯）和δC31.9（伯）遠程偶合相關，結合HSQC，可歸屬H-29 [δH1.38（3H，s）]、H-30 [δH1.43（3H，s）]、C-29 [δC30.3（伯）]和 C-30 [δC31.9（伯）].但由于 C21-C22 可以自由旋轉，借助于HMBC或者NOESY譜圖（圖S12）均無法確定H-29（C-29）和H-30（C-30）的準確位移，亦即這兩組數據可以互換.基于HMBC譜中δH0.93（3H，s）與C-17和C-18的遠程相關信號，將其歸屬為甲基質子H-28，結合HSQC譜圖，可指認C-28 [δC16.9（伯）].H-28和δC50.6（叔）、δC42.2（仲）在HMBC譜中遠程偶合相關，結合HSQC譜圖，可準確歸屬 C-13 [δC50.6（叔）]、C-19[δC42.2（仲）]、H-13 [δH1.44（1H，m）]和 H-19 [δH1.60（1H，m）和δH1.00（1H，m）].E環的所有質子和碳原子信號得到歸屬.

HMBC 譜中，δH2.21（1H，ddt，J=12.9/4.5/2.4 Hz）與 C-18、δC35.1（仲）、δC42.6（季）遠程偶合相關，HSQC譜中，該質子和δH1.80（1H，m）與δC22.7（仲）相關，NOESY譜中，δH2.21（1H，ddt，J=12.9/4.5/2.4 Hz）與H-29和 H-30相關，歸屬δH2.21（1H，ddt，J=12.9/4.5/2.4 Hz）和 1.80（1H，m）為 H-16，δC22.7（仲）為 C-16，δC35.1（仲）為 C-15，δC42.6（季）為 C-14.HMBC譜中，δH0.90（3H，s）與C-13、C-14、C-15遠程偶合相關，歸屬δH0.90（3H，s）為H-27.結合HSQC譜，可準確歸屬C-27、H-15.D環歸屬完畢.

HMBC譜中，δH1.03（3H，s）與C-9、C-14、δC34.1（仲）、δC42.6（季）遠程偶合相關，H-5與δC19.1（仲）、δC34.0（仲）遠程偶合相關，歸屬δH1.03（3H，s）為H-26，δC19.1（仲）為C-6，δC34.1（仲）為C-7，δC42.6（季）為C-8.結合HSQC譜可歸屬C-26、H-6和H-7.值得注意的是，C-8和C-14相差僅0.02 ppm，利用HMBC譜中H-16和C-14的遠程偶合相關信號可確認C-14位于較低場.B環歸屬完畢.此時僅余H-11（C-11）和H-12（C-12）未歸屬，但由于結構中沒有僅與C-11或者C-12遠程相關的質子，NOESY譜中這兩組質子未見與H-25、H-26、H-27、H-28的相關信號，無法準確歸屬，借助于化合物2中H-11（C-11）和H-12（C-12）的位移，歸屬δH1.62（1H，m）和δH1.35（1H，m）為H-11，δH1.44（2H，m）為H-12，δC21.7（仲）為C-11，δC24.9（仲）為C-12.所有信號歸屬完畢.HMBC和NOESY譜中主要相關信號如圖7所示.

化合物1的所有1H NMR和13C NMR數據如表3所示.

圖7 化合物1中主要的1H-13C遠程偶合相關(→)和1H-1H NOE相關(?)Fig. 7 Selected key 1H-13C heteronuclear multiple-bond connectivity (→) and 1H-1H NOESY correlations (?) of compound 1

表3 化合物1的1H和13C NMR實驗數據（溶劑：Pyridine-d5）和文獻數據（溶劑：CDCl3）Table 3 1H and 13C NMR experimental data (Solvent: Pyridine-d5) and documentary data (Solvent: CDCl3)of compounds 1

續表3Continuation of the Table 3

2.3 化合物1和化合物2的差異

何伯烷類化合物是重要的五環三萜，但對于其中的 3α,22-二羥基何伯烷（化合物 1）和 3β,22-二羥基何伯烷（化合物2），文獻[2,3]僅報道了這兩個化合物的部分NMR數據.化合物1和2的1H NMR和13C NMR的完整歸屬，對何伯烷類化合物的結構確認具有重要的參考意義.

從歸屬結果可以看出，相較于β-異構體（2），α-異構體（1）的H-3與H-2之間的偶合常數更小，且位于較低場，與文獻[5,8]所述相符.NOESY實驗表明，α-異構體（1）的H-3與H-23和H-24這兩個甲基質子之間均有NOE效應，而β-異構體（2）的H-3僅與H-23有NOE效應，并且與H-5有NOE效應[11].除了H-3的化學位移和偶合常數外，化合物1和2這兩種異構體的H-1、H-5和H-24的化學位移差異較其他質子更大，H-5和H-24可以作為鑒別兩種異構體的特征信號.此外，兩種異構體的C-1、C-5以及C-24的化學位移也存在較大差異.

通過對比發現，本文中歸屬的NMR數據與文獻中數據存在一些出入，一部分可能是由于溶劑不同造成的：文獻[2,3]使用溶劑為CDCl3，文獻[8]使用溶劑為C6D6，本文選擇C5D5N作為溶劑.此外，文獻[8]歸屬δC18.73為3β-羥基何伯烯的C-5和C-7，而本文將δC56.1和δC34.1分別歸屬為化合物2的C-5和C-7，這可能是由于文獻[8]的歸屬錯誤造成的.

化合物1和化合物2構型不同除了影響氫核和碳核的化學位移之外，兩者的1H-13C遠程偶合相關也有差別.最明顯的是化合物1的H-3和C-1、C-5、C-24遠程偶合相關，而化合物2的H-3與C-4、C-23、C-24遠程偶合相關.HMBC譜中氫核和碳核的多鍵偶合常數（nJH,C）通常選擇8 Hz，這個數值能夠滿足絕大部分的兩鍵（2JH,C）或者三鍵（3JH,C）的碳氫偶合常數.而化合物1和化合物2的H-3所處位置不同，導致與H-3的偶合常數為8 Hz（nJH,C=8 Hz）的碳原子也不相同.

3 結論

本文通過XRD實驗確定了3β,22-二羥基何伯烷（2）的絕對構型，在此基礎上，完整歸屬和確認了3α,22-二羥基何伯烷（1）和3β,22-二羥基何伯烷（2）的1H和13C NMR數據.此外，通過保護羥基來分離單一構型的化合物1和化合物2這兩種異構體的方法也同樣適用于其他各種難以分離的α-和β-異構體.

致謝

感謝河南城建學院胡繼勇教授提供單晶測試和解析幫助.

利益沖突

無

附件材料

圖S1 化合物2的1H NMR (a)全譜和(b)局部放大譜圖.

圖S2 化合物2的HSQC譜圖.

圖S3 化合物2的COSY譜圖.

圖S4 化合物2的13C NMR (a)全譜和(b)局部放大譜圖.

圖S5 化合物2的DEPT譜圖.

圖S6 化合物2的NOESY譜圖.

圖S7 化合物1的1H NMR (a)全譜和(b)局部放大譜圖.

圖S8 化合物1的13C NMR (a)全譜和(b)局部放大譜圖.

圖S9 化合物1的DEPT譜圖.

圖S10 化合物1的COSY譜圖.

圖S11 化合物1的HSQC譜圖.

圖S12 化合物1的NOESY譜圖.