茶樹尿卟啉原脫羧酶基因CsHEME2的克隆與生物信息學分析

高羲之，張晨禹，陳建姣，易曉芹，李云飛，陳佳豪，沈程文

湖南農業大學 園藝學院/茶學教育部重點實驗室/國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128

茶樹 [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]是我國重要的經濟作物。據中國茶葉流通協會統計，2019年我國18個主要產茶?。ㄗ灾螀^、直轄市）茶園面積為306.52萬hm2，干毛茶產量為279.34萬t，干毛茶總產值達到2396億元[1]。伴隨著近十年工業化的高速發展，我國酸雨問題日益嚴重，已成為繼歐洲和北美之后世界第三大酸雨區，中國降水年均pH值小于5.6的面積約占國土面積的40%，長江中下游以南地區至少50%以上的面積降水年均pH值小于4.5，為酸雨重污染區[2]。盡管2018年酸雨發生面積相比2003年減少97萬km2[3]，但酸雨仍是不可忽視的嚴重環境問題。茶樹雖屬喜酸性木本植物，但強酸性土壤對茶樹的生長和茶葉品質仍會造成嚴重影響[4]。我國茶樹種植區大多受到酸雨的污染，探究茶樹的抗酸雨脅迫機制具有重要意義。

葉綠素是綠色植物葉綠體內最重要的色素之一，參與光合作用，具有捕獲光能及吸收與傳遞光量子的功能。有研究表明，輕度酸雨脅迫促進茶樹葉綠素的合成，而在重度酸雨脅迫下葉綠素含量降低，進而影響光合作用[5]。葉綠素生物合成可分為15步反應，主要包括兩大部分：L-谷氨酰-tRNA→原卟啉Ⅸ（proto Ⅸ）和原卟啉Ⅸ（proto Ⅸ）→葉綠素[6]。尿卟啉原脫羧酶參與第一部分的生物合成，由HEME1和HEME2基因編碼，是葉綠素生物合成的關鍵酶。目前國內外對HEME2基因的研究仍十分稀缺，有待進一步的發現。

本試驗在模擬酸雨脅迫茶樹幼苗成熟葉片轉錄組測序的基礎上，通過分析轉錄組測序數據，在轉錄水平上初步探索了茶樹對酸雨脅迫的應答機制，篩選出了HEME2基因，通過RTPCR技術克隆其CDS區全長序列并對其進行生物信息學分析，同時采用qRT-PCR技術對酸雨處理葉和正常葉基因表達差異進行分析，旨在為后續抗酸性茶樹新品種篩選和培育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗使用的材料為模擬酸雨脅迫處理的一年生茶樹品種湘妃翠幼苗。從湖南省長沙縣高橋鎮茶苗繁育基地將茶樹幼苗移栽至湖南省長沙市湖南農業大學耘園實驗基地（北緯28°18′12″，東經 113°07′61″），置于通風遮頂塑料大棚內。采用裝有紅壤的塑料花盆（底直徑18 cm，口直徑 23 cm，高 25 cm）以盆栽方式進行培養，培育期間澆灌自來水并補充定量肥料。茶苗長勢正常后分為處理組和對照組，設置處理組pH=2.5，對照組pH=6.5，采用濃硫酸與濃硝酸4:1混合配制成酸雨母液，稀釋至相應pH值，采用便攜式pH計調節pH值，依據長沙地區年平均降水量進行酸雨噴淋，每4 d一次，每盆450 mL，全株噴淋。處理兩個月（2018年4月19日至6月19日），于2018年6月采摘成熟葉片作為供試材料，放入-80℃冰箱保存備用。

1.2 葉綠素含量測定

按盧翠報道的方法測定[7]。

1.3 抗氧化酶活性測定

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性，分別使用科銘生物的SOD活性檢測試劑盒（SOD-1-Y）、POD活性檢測試劑盒（POD-1-Y）、CAT活性檢測試劑盒（CAT-1-Y）和APX活性檢測試劑盒（APX-1-W）檢測。

1.4 總RNA提取和cDNA合成

將供試材料用液氮研磨后取 0.1 ～ 0.2 g，采 用 TIANGEN 的 RNAprep Pure Plant Kit （Polysaccharides & Polyphenolics-rich） 試 劑 盒提取茶樹總RNA，RNA完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，濃度和純度使用Nano-Drop 2000超微量分光光度計測定，于-80℃冰箱保存備用。 采用TaKaRa的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒反轉錄合成cDNA。

1.5 CsHEME2 基因 CDS 區克隆

根據轉錄組測序數據（登錄號：PRJNA 575691）得到CsHEME2基因CDS區序列，引物設計和合成由湖南擎科生物技術有限公司完成（表1）。50 μL RT-PCR擴增體系為：I-5TM 25High-Fidelity Master Mix 25.0 μL， 上 游 引 物2.0 μL，下游引物 2.0 μL，模板 DNA 1.0 μL，ddH2O 20.0 μL，總體積 50.0 μL。PCR 擴增反應條件：98℃變性 10 s，56℃退火 15 s，72℃延伸 10 s，35 個循環；72℃延伸 5 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后切膠回收，將回收產物連接至載體 pClone 007 Blunt Vector（擎科生物），轉入大腸桿菌Trelief TM 5e感受態細胞（擎科生物），37℃培養箱倒置過夜培養。挑取白色陽性單克隆菌落擴大培養，挑選3個陽性克隆菌液送至湖南擎科生物技術有限公司 測序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 CsHEME2 基因生物信息學分析

通過在線分析工具Protparam和Protscale[8]對CsHEME2基因進行理化性質和親/疏水性分析， 通 過 SignalP[9]、ChloroP[10]和 TargetP[11]進行信號肽、葉綠體轉運肽預測和亞細胞定位預測，通過TMHMM和Netphos[12]進行蛋白質跨膜結構和磷酸化位點預測，通過SOPMA[13]和Phyre2[14]模擬CsHEME2基因編碼蛋白質二級和三級結構，通過BLAST工具分析CsHEME2基因與其他物種氨基酸序列同源性，并用DNAMAN與其它16種植物進行多重氨基酸序列比對，通過MEGA 7.0采用鄰位連接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹。

1.7 CsHEME2 基因表達差異分析

根據克隆測序所得的CsHEME2基因CDS區全長序列設計qRT-PCR引物qCsHEME2-F和qCsHEME2-R（表1），引物由湖南擎科生物技術有限公司合成，所使用的內參基因為β-actin（表 1）。使用 TaKaRa 的 TB Green?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）試劑盒檢測CsHEME2基因的表達水平。20 μL熒光定量PCR反應體 系 為：TB GreenPremix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2X）10.0 μL，ROX Reference Dye II （50X）0.4 μL，上游引物 0.4 μL，下游引物 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL，模板 DNA 2.0 μL，總體積 20.0 μL。配置完成后在Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR分析儀上檢測CsHEME2基因表達，反應程序為：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，45 個循環。使用Excel 2016按照[15]算法進行計算。

2 結果與分析

2.1 CsHEME2基因CDS區的克隆及序列分析

通過RT-PCR技術克隆獲得約1200 bp的目的片段（圖1），片段大小基本上符合預期，可以確定克隆所得的目的片段為CsHEME2基因CDS區。該序列全長共1182 bp，編碼393個氨基酸殘基，含有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA（圖2）。

圖1 CsHEME2基因電泳圖Figure 1 Elctrophoretogram of CsHEME2

2.2 CsHEME2 基因生物信息學分析

2.2.1 理化性質及親/疏水性

通過在線工具Protparam分析表明，CsHEME2蛋白的原子組成為C1957H3084N516O563S10，分子質量約為43.17 kDa，理論等電點（pI）約為 6.73 < 7，為酸性蛋白。CsHEME2蛋白共含有20種基本氨基酸殘基，其中纈氨酸Val（V）的含量最高，占10.7%；半胱氨酸Cys（C）的含量最低，占0.8%。在393個氨基酸殘基中，共含有40個負電荷氨基酸（Asp + Glu）和39個正電荷氨基酸（Arg + Lys）（圖2）。該蛋白水溶液在280 nm處的消光系數為35535，脂肪族氨基酸指數為96.90，不穩定指數為37.28，為穩定蛋白。在體外哺乳動物網織紅細胞中的半衰期為30 h，在酵母體內大于20 h，在大腸桿菌內大于10 h。其親水性平均系數（GRAVY）為 0.017 > 0，屬于疏水蛋白。

圖2 CsHEME2基因CDS區核苷酸序列和推導氨基酸序列Figure 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of CsHEME2 gene CDS region

根據在線軟件Protscale預測結果顯示，位于CsHEME2蛋白肽鏈上第91位的色氨酸Ser（S）具有最低的分值-2.522，親水性最弱；位于第189位的甘氨酸Gly（G）具有最高的分值2.178，疏水性最強（圖3）。但從整體上看，CsHEME2蛋白肽鏈上疏水性氨基酸較親水性氨基酸多，說明該蛋白為疏水性蛋白。

圖3 CsHEME2蛋白的親水性/疏水性預測Figure 3 Hydrophilic / hydrophobic analysis of CsHEME2 protein

2.2.2 信號肽、葉綠體轉運肽及亞細胞定位預測

信號肽用于指導蛋白質的跨膜轉移，信號肽行使完功能后其自身的序列在信號肽酶的作用下被切除[16]。SignalP預測結果顯示，CsHEME2蛋白的多肽鏈無信號肽屬于非分泌蛋白（圖4）。ChloroP預測結果顯示，CsHEME2蛋白存在葉綠體轉運肽剪切位點，位于第43個氨基酸，含有葉綠體轉運肽（圖2）。TargetP預測結果顯示CsHEME2蛋白定位于葉綠體，這與信號肽預測結果一致，可以推測CsHEME2蛋白在游離的核糖體中合成后需要轉運到葉綠體上發揮作用。

圖4 CsHEME2蛋白信號肽預測Figure 4 Signal peptide prediction of CsHEME2 protein

2.2.3 跨膜結構域及磷酸化位點預測

跨膜結構域是細胞膜中蛋白與膜脂相結合的主要部位，一般由約20個疏水性氨基酸殘基組成形成α-螺旋，它固著在細胞膜上起“錨定”作用[17]。根據預測結果，蛋白質可分為跨膜蛋白和非跨膜蛋白。TMHMM預測結果如圖5所示，CsHEME2蛋白各氨基酸位點處于膜外的概率極接近1，可信度較高，這表明CsHEME2蛋白整條多肽鏈位于細胞膜外，不存在跨膜區，說明該蛋白屬于非跨膜蛋白。磷酸化是常見的蛋白質翻譯后修飾類型，它在調節蛋白質活性、結構和功能等方面發揮著重要作用。Netphos預測結果（圖6）顯示，該蛋白含有36個可能發生磷酸化的位點，其中包括24個絲氨酸（Ser）位點、9個蘇氨酸（Thr）位點以及3個酪氨酸（Tyr）位點。

圖5 CsHEME2蛋白的跨膜結構域預測Figure 5 Transmembrane domain prediction of CsHEME2 protein

圖6 CsHEME2蛋白質磷酸化位點預測Figure 6 Phosphorylation sites prediction of CsHEME2 protein

2.2.4 二、三級結構及蛋白功能域預測

蛋白質二級結構是指多肽鏈的氨基酸殘基借助氫鍵折疊和盤繞形成的結構，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角、延伸鏈和無規則卷曲等[18]。SOPMA預測結果顯示該蛋白包含4種二級結構形式，其中α-螺旋占39.19%，是CsHEME2蛋白最主要的二級結構；其次無規則卷曲、延伸鏈和β-轉角分別占35.62%、18.32%和6.87%，不存在β-折疊（圖7-A）。Phyre2預測結果如圖7-B所示，CsHEME2蛋白質三級結構多由α-螺旋和無規則卷曲構成，這與二級結構預測的結果相符，并且HEME2蛋白質三級結構模型與其模板d1j93a的相似性高達90%，說明所預測的結構較可靠。

圖7 CsHEME2蛋白質的二級和三級結構預測Figure 7 Secondary structure and tertiary structure prediction of CsHEME2 protein

使用NCBI網站中的在線工具CD-Search預測CsHEME2蛋白結構域，結果如圖8所示。CsHEME2含有PLN02433保守結構域（圖2），屬于URO-D_CIMS_like超家族；PLN02433含有6個活性位點（Active site），分別位于CsHEME2蛋白多肽鏈上第73位（R）、第77位（R）、第123位（D）、第200位（Y）、第255位（S）和第370位（H）氨基酸，另外還含有26個底物結合位點（Substrate binding site）。

圖8 CsHEME2蛋白質功能域預測Figure 8 Functional domains prediction of CsHEME2

2.2.5 多重氨基酸序列比對及進化樹分析

利用NCBI網站的Blastp在線分析茶樹CsHEME2基因編碼蛋白質的氨基酸序列與其它物種的氨基酸同源性，結果顯示，中華獼猴桃、葡萄和核桃等7種植物與CsHEME2基因氨基酸序列同源性達到了90%以上，CsHEME2基因氨基酸序列與模式植物擬南芥AtHEME2基因的氨基酸同源性達到79%、與‘舒茶早’茶樹CsHEME2基因的氨基酸同源性達到98%。通過DNAMAN對CsHEME2基因氨基酸序列和16個與其氨基酸同源性較高的物種進行多重氨基酸序列比對（圖9），可以發現，這16個物種均含有PLN02433保守結構域以及該結構域所含的活性位點和底物結合位點。使用MEGA7.0軟件采用內置的鄰位連接法構建系統進化樹（圖10），結果表明整體聚為兩大類，各類再分為多個小類；其中茶樹和中華獼猴桃聚為一類，親緣關系最近，這可能與茶樹和中華獼猴桃同源性較高有關；木薯和橡膠樹聚為一類，屬于大戟科植物；胡楊和毛果楊聚為一類，屬于楊柳科植物；西葫蘆、黃瓜和甜瓜聚為一類，屬于葫蘆科植物。不同科之間的物種也有較近的親緣關系，如胡桃科的核桃和木棉科的榴蓮，以及茜草科的小果咖啡和茄科的番茄等。

圖9 HEME2多序列比對Figure 9 Multiple sequence alignment of HEME2

圖10 不同植物間HEME2基因系統進化樹Figure 10 Polygenetic tree of HEME2 from different plants

2.3 CsHEME2 基因表達差異分析

利用qRT-PCR技術檢測了本試驗克隆的CsHEME2基因在模擬酸雨脅迫處理葉片和正常葉片中的表達水平（圖11），結果顯示該基因在模擬酸雨脅迫處理葉片中的相對表達量比在正常葉片中高并存在極顯著差異，這與轉錄組數據相符[19]。葉綠素含量測定的結果顯示（表2），酸雨葉片中的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a/b含量均比正常葉片低，且存在極顯著差異，結合qRT-PCR結果可推測CsHEME2基因對葉綠素的生物合成是負反饋調節。

圖11 CsHEME2在不同葉片中的表達差異分析Figure 11 Analysis of differential expression of CsHEME2 in different leaves

表2 模擬酸雨對茶樹幼苗葉片葉綠素含量的影響（平均值±標準差）Table 2 Effects of simulated acid rain on chlorophyll content in leaves of tea seedlings (mean value ± standard deviation)

2.4 抗氧化酶活性分析

SOD、POD、CAT、APX均是植物細胞內具有的重要抗氧化酶，在植物抗逆生理中起著關鍵作用，當植物處于逆境時，抗氧化酶對維持植物正常生長有著十分密切的關系。如圖12所示，四種抗氧化酶活性在pH值2.5的酸雨脅迫下都顯著提高，表明酸雨脅迫觸發了茶樹的防御機制以抵抗脅迫。

圖12 模擬酸雨對茶樹幼苗葉片抗氧化酶活性的影響Figure 12 Effects of simulated acid rain on antioxidant enzyme activities in leaves of tea seedling

3 討論

HEME2基因廣泛存在于植物、真菌及細菌中，是四吡咯代謝的關鍵酶基因，與葉綠素合成及血紅素的合成有關。但是，近年來國內外對HEME2基因的研究較少。本試驗以茶樹為材料，克隆了CsHEME2基因，并分別進行了生物信息學分析和表達分析。

試驗通過RT-PCR技術克隆了CsHEME2基因CDS區，序列全長共1182 bp，編碼393個氨基酸殘基，通過生物信息學分析發現其編碼的氨基酸具有植物HEME2的PLN02433保守結構域，并含有此結構域特有的活性位點和底物結合位點；多序列比對顯示CsHEME2與中華獼猴桃、葡萄和核桃等7種植物HEME2氨基酸序列同源性達到了90%以上，與“舒茶早”茶樹品種的CsHEME2基因的氨基酸同源性達到98%，試驗所克隆的基因屬于植物HEME家族成員。進化樹分析結果顯示，茶樹和中華獼猴桃聚為一類，親緣關系最近，這可能與茶樹和中華獼猴桃同源性較高以及同屬于山茶目植物有關，表明HEME2在近似物種中具有較高的保守性，這與王希希[20]和閆菲[21]等的研究結果相似。對蛋白結構的分析結果表明，CsHEME2蛋白屬于酸性疏水蛋白，含有葉綠體轉運肽，主要在葉綠體中發揮作用，表明四吡咯代謝的部分反應可能在葉綠體中進行。

轉錄組測序結果顯示，在卟啉和葉綠素代謝通路中只有編碼尿卟啉原脫羧酶的HEME1和HEME2基因出現差異表達并且表達上調，并通過qRT-PCR驗證顯示HEME2在酸雨葉片的相對表達量比在正常葉片中高，結合葉綠素含量測定結果可推測HEME2基因的轉錄表達受酸雨脅迫誘導，表達上調并負反饋調節葉綠素的生物合成，使葉綠素含量下降；同時也有研究表明，質體中增加的四吡咯代謝中間產物可以觸發整個細胞的抗氧化反應[22]，尿卟啉原脫羧酶在葉綠素合成通路中催化尿卟啉原Ⅲ轉化為糞卟啉原Ⅲ，酸雨脅迫下尿卟啉原脫羧酶受到抑制，導致四吡咯中間體尿卟啉原III（Uroporphyrinogen III）的過度積累，尿卟啉原III作為一種強光敏劑很容易被光激發，如果不及時淬滅，可能會導致形成劇毒的自由基和單線態氧[23]，使細胞遭受損傷，但同時四吡咯中間體的積累觸發了細胞保護和防御機制[22]，這與本試驗結果一致，四種抗氧化酶活性在模擬酸雨脅迫下都顯著提高，推測尿卟啉原III的積累使茶樹對模擬酸雨脅迫產生了氧化應激以抵抗脅迫。綜上，可以推測HEME2基因在響應酸雨脅迫中發揮一定的作用。

本試驗采用RT-PCR方法對茶樹HEME2基因CDS區進行克隆，初步探索了茶樹中HEME2基因的表達和對酸雨脅迫的響應并進行了生物信息學分析，為進一步研究該基因在茶樹酸雨脅迫中的功能奠定基礎。有關HEME家族基因的深入分析和功能鑒定，還有待進一步深入研究，可通過亞細胞定位、基因沉默技術和轉基因等方法實現。