丹參多酚酸鹽對腎間質纖維化模型大鼠的改善作用及機制研究

魏丹丹 張超 朱星昊 梁磊 李閃閃 劉湘花 李真珍 蔣士卿

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）08-0915-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.08.04

摘 要 目的：研究丹參多酚酸鹽對腎間質纖維化（RIF）模型大鼠的改善作用及可能機制。方法：將50只雄性SD大鼠按體質量隨機分為正常組、模型組、氯沙坦組（陽性對照組，9 mg/kg）和丹參多酚酸鹽低、高劑量組（18、36 mg/kg），每組10只。除正常組外，其余各組大鼠均灌胃腺嘌呤250 mg/kg建立RIF模型。造模結束后，各給藥組大鼠灌胃相應藥物，正常組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，灌胃體積均為10 mL/kg，每天1次，連續30天。末次給藥后，采用酶聯免疫吸附測定法檢測大鼠血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）和尿液中24 h尿蛋白（24 h UPro）水平;采用蘇木精-伊紅染色法和Masson染色法分別觀察大鼠腎組織病理學特點和纖維化情況，對腎小管損傷、腎小球硬化程度進行評分并計算腎組織陽性染色面積百分比;采用免疫組化法和Western blot法分別測定大鼠腎組織中Wnt蛋白（Wnt5a、Wnt5b）、β-聯蛋白（β-catenin）的表達水平。結果：與正常組比較，模型組大鼠Scr、BUN、24 h UPro水平和腎小管損傷評分、腎小球硬化評分、腎組織陽性染色面積百分比以及Wnt5a、β-catenin蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05），Wnt5b蛋白的表達水平顯著降低（P<0.05）;顯微鏡下可見大鼠腎組織出現系膜增生、纖維組織增多、炎性細胞浸潤等病理學變化。與模型組比較，氯沙坦組和丹參多酚酸鹽低、高劑量組大鼠的上述指標均顯著改善（P<0.05），且丹參多酚酸鹽的作用具有一定的劑量依賴性趨勢。結論：丹參多酚酸鹽對腺嘌呤致RIF模型大鼠具有改善作用，其機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。

關鍵詞 丹參多酚酸鹽;腺嘌呤;腎間質纖維化;腎功能;Wnt蛋白/β-聯蛋白信號通路;大鼠

Study on Improvement Effect of Salvianolate on Renal Interstitial Fibrosis Model Rats and Its Mechanism

WEI Dandan1，ZHANG Chao1，ZHU Xinghao1，LIANG Lei1，LI Shanshan1，LIU Xianghua1，LI Zhenzhen2，JIANG Shiqing1（1. First Clinical College， Henan University of TCM， Zhengzhou 450046， China; 2. Medical Research Center， the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450052， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effect of salvianolate on renal interstitial fibrosis （RIF） model rats and its possible mechanism. METHODS： Totally 50 male SD rats were randomly divided into normal group， model group， losartan group （positive control group， 9 mg/kg） and salvianolate low-dose and high-dose groups （18， 36 mg/kg） according to body weight， with 10 rats in each group. Except for normal group， other groups were given adenine 250 mg/kg intragastrically to establish RIF model. After modeling， administration groups were given relevant medicine intragastrically， and normal group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， the volume was 10 mL/kg， once a day， for consecutive 30 days. After last medication， the serum levels of creatinine （Scr）， urea nitrogen （BUN） and 24 h proteinuria （24 h UPro） were detected by ELISA. HE staining and Masson staining were used to observe the histopathological characteristics and fibrosis of the kidney. The degree of renal tubular injury and glomerulosclerosis were scored， and the percentage of positive staining area of renal tissue was calculated;immunohistochemistry and Western blot assay were used to determine the protein expression of Wnt5a， Wnt5b， and β-catenin. RESULTS： Compared with normal group， Scr， BUN and 24 h UPro levels， renal tubular injury score，? glomerulosclerosis score， the percentage of positive staining area in renal tissue， the protein expression of Wnt5a and β-catenin were increased significantly in model group （P<0.05）， while the expression of Wnt5b protein was decreased significantly （P<0.05）. Pathological changes such as mesangial hyperplasia， fibrous tissue increase and inflammatory cell infiltration were observed under microscope. Compared with model group， above indexes of rats were improved significantly in losartan group， salvianolate low-dose and high-dose groups （P<0.05）， and the effect of salvianolate had dose-dependent trend. CONCLUSIONS： Salvianolate has the improvement effect on RIF model rats induced by adenine， and its mechanism may be related to inhibition of Wnt/β-catenin signal pathway.

KEYWORDS? ?Salvianolate; Adenine; Renal interstitial fibrosis; Renal function; Wnt/β-catenin signal pathway; Rat

腎間質纖維化（RIF）是各種病理因素引發的慢性腎病發展至終末期腎衰竭的主要病理特征，主要包括腎血管纖維化、腎小球硬化和腎小管間質纖維化[1-2]。RIF發生的主要環節包括炎性細胞浸潤、致纖維化因子激活、腎小管上皮細胞-腎間質肌成纖維細胞分化以及細胞外基質過度沉積等[3]。目前研究認為，纖維化期是腎病治療的關鍵時期，若患者在此時期能得到及時、有效的治療，便能有效緩解其疾病進展，從而提高患者生活質量[4]。

中醫學認為，RIF的主要病機為腎脈瘀阻，其中瘀血是主要的致病因素[5]。因此，可采用祛瘀通腎法進行治療，發揮活血祛瘀、恢復腎氣、改善腎臟缺血狀態、調節微循環和腎血流動力學異常狀態等作用，以減緩RIF的發展。丹參多酚酸鹽為活血化瘀中藥丹參Salvia mil- tiorrhiza Bge.的主要活性成分，目前主要用于心腦血管疾病的治療，其具有較好的抗氧化、促進血管新生等作用[6]。Wnt蛋白/β-聯蛋白（Wnt/β-catenin）信號通路是目前研究腎臟固有細胞轉化成肌成纖維細胞（即上皮間質轉化調控機制）的主要通路之一，故可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路活化來延緩腎纖維化進程[7-9]。鑒于此，本研究基于中醫祛瘀通絡的治療理念，選用活血化瘀類常用中藥丹參的活性成分丹參多酚酸鹽對RIF模型大鼠進行干預，觀察其對大鼠腎臟功能及纖維化的影響，并通過考察Wnt/β-catenin通路相關蛋白的表達情況來探討丹參多酚酸鹽對RIF模型大鼠的改善作用及可能機制，旨在為丹參多酚酸鹽的臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

MR-96TB型酶標儀購自騁克儀器（上海）有限公司;YD-6D型組織包埋機、YD-A型組織攤片機、YD-B型組織烤片機均購自金華市科迪儀器設備有限公司;RM2235型石蠟切片機購自德國Leica公司;D3024R型臺式高速冷凍微量離心機購自大龍興創實驗儀器（北京）有限公司;DN260型滅菌鍋購自浙江新豐醫療器械有限公司;HWS-24型水浴鍋購自上海齊欣科學儀器有限公司;SG-300型顯微鏡購自蘇州神鷹光學有限公司;ChemiScope 6200 Touch型化學發光成像儀購自上海勤翔科學儀器有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

注射用丹參多酚酸鹽[批號18120224，規格每瓶裝50 mg（含丹參乙酸鎂40 mg）]購自上海綠谷制藥有限公司;氯沙坦鉀片（批號429001，規格50 mg）購自重慶科瑞制藥（集團）有限公司;腺嘌呤（批號S18009）、Masson染色試劑盒（批號G1340）均購自北京索萊寶科技有限公司;血尿素氮（BUN）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號C011-1-1）、血肌酐（Scr）ELISA試劑盒（批號C013-1-1）、24 h尿蛋白（24 h UPro）ELISA試劑盒（批號C035-2-1）均購自南京建成生物工程研究所;兔SP試劑盒（批號SP-9001）、DAB顯色試劑盒（批號ZLI-9017）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司;BCA蛋白定量檢測試劑盒（批號C05-02001）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒（批號C-0047）、兔抗大鼠Wnt5a單克隆抗體（批號bs-1948R）、兔抗大鼠Wnt5b單克隆抗體（批號bs-8010R）、兔抗大鼠β-catenin單克隆抗體（批號bs-1165R）均購自北京博奧森生物技術有限公司;兔抗大鼠β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號GB12001）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號GB23303）均購自武漢塞維爾生物科技有限公司;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為蒸餾水。

1.3 動物

健康SPF級SD大鼠50只，雄性，體質量150～200 g，購自河南省實驗動物中心，生產許可證號為SCXK-（豫）2015-0004。動物購買后按嚙齒類動物一級環境條件飼養于河南中醫藥大學實驗動物基地，實驗過程依照河南中醫藥大學動物倫理委員會和國家實驗動物管理的相關規定進行。所有大鼠均以普通飼料適應性飼養14天后開始實驗。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將50只大鼠按體質量隨機分為正常組、模型組、氯沙坦組（陽性對照，9 mg/kg，成人臨床用量的等效劑量）和丹參多酚酸鹽低、高劑量組（18、36 mg/kg，分別為成人臨床用量的等效劑量和2倍等效劑量），每組10只。除正常組外，其余各組大鼠均按250 mg/kg灌胃2.5%的腺嘌呤生理鹽水混懸液以復制RIF模型：先每天灌胃1次，連續12 天;然后改為隔天灌胃1次，連續12 天，共24天[1];正常組大鼠在造模期間同步灌胃等體積生理鹽水。造模結束后，各給藥組大鼠灌胃相應藥物（以生理鹽水溶解），正常組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水;灌胃體積均為10 mL/kg，每天1次，連續30天。

2.2 大鼠標本采集及處理

末次給藥后，收集各組大鼠24 h尿液。然后腹腔注射氨基甲酸乙酯麻醉。于腹主動脈取血，血樣以3 000 r/min離心10 min，取上層血清。然后將大鼠處死，解剖取其腎組織，以生理鹽水沖洗后，一部分保存于4 %多聚甲醛溶液中用于制作病理切片;另一部分保存于凍存管中，經液氮速凍后放入-80 ℃冰箱中凍存，用于Western blot實驗。

2.3 大鼠血清中Scr、BUN水平和尿液中24 h UPro水平檢測

采用ELISA法以酶標儀檢測血清中Scr、BUN水平和尿液中24 h UPro水平，具體操作嚴格按照相應試劑盒說明書方法進行。

2.4 大鼠腎臟病理組織學觀察

2.4.1 蘇木精-伊紅染色 取4%多聚甲醛溶液固定的腎組織適量，經脫水、透明、包埋后切片（厚度約4 μm），進行常規蘇木精-伊紅（HE）染色，然后在顯微鏡下進行觀察。每張切片隨機選出5個不重疊的腎皮質區，根據染色程度對腎小管損傷和腎小球硬化情況分別進行評分：正常，記為0分;輕度染色（染色面積≤25%），記為1分;中度染色（染色面積>25%～50%），記為2分;重度染色（染色面積>50%～75%），記為3分;極重度染色（染色面積>75%），記為4分[1]。取平均值作為評價結果。

2.4.2 Masson染色 另取上述石蠟切片經二甲苯脫蠟后，按Masson試劑盒說明書方法進行染色，其中肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色。采用Image J v1.8.0軟件測定每個視野中藍色陽性染色面積占總面積的百分比（簡稱“陽性染色面積百分比”），以此評價腎小管萎縮及腎間質纖維化水平[1]。

2.5 大鼠腎組織中Wnt5a、Wnt5b、β-catenin蛋白表達水平檢測

2.5.1 免疫組化法 取石蠟切片經脫蠟、水化后，H2O2封閉，然后以磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，以檸檬酸鹽緩沖液于121 ℃下熱修復，再滴加山羊血清封閉液，室溫孵育1 h后傾去液體，分別滴加Wnt5a、Wnt5b、β-catenin一抗（稀釋比例均為1 ∶ 100），4 ℃孵育過夜;滴加HRP標記的羊抗兔IgG二抗（稀釋比例均為1 ∶ 100），37 ℃孵育20 min。DAB顯色，水沖洗，蘇木精復染1～2 min;1%鹽酸乙醇溶液分化，水再次沖洗;然后經常規脫水、透明、封片后置于顯微鏡下檢示（目標蛋白會被染成棕黃色），每組選取3張切片，采用Image-Pro Plus 6.0軟件測定每個視野中細胞的積分光密度（IOD）值，取平均值作為檢測結果。

2.5.2 Western blot法 取腎組織，用冷PBS洗去血污后剪成小塊置于勻漿管中，加入10倍體積的RIPA裂解液徹底勻漿，冰浴30 min后，以12 000 r/min離心10 min，收集上清，即為總蛋白溶液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量分析后，加入上樣緩沖液，沸水浴15 min使蛋白變性。取變性后蛋白適量，進行SDS-PAGE（濃縮膠電壓75 V，分離膠電壓120 V），然后以300 mA恒流電轉30 min至聚偏二氟乙烯膜上;5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入Wnt5a、Wnt5b、β-catenin、β-actin一抗（稀釋比例均為1 ∶ 3 000），4 ℃孵育過夜;TBST漂洗5 min×3次，加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗（稀釋比例均為1 ∶ 3 000），室溫孵育30 min;TBST漂洗5 min×3次，使用ECL試劑盒顯色，于化學發光成像儀上成像，然后采用Image J v1.8.0軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白條帶與內參蛋白（β-actin）條帶的灰度值比值表示目標蛋白的表達水平。

2.6 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。實驗數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析;方差齊者組間兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊者組間兩兩比較采用Dennetts檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 丹參多酚酸鹽對RIF模型大鼠血清中Scr、BUN水平和尿液中24 h UPro水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中Scr、BUN水平和尿液中24 h UPro水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中Scr、BUN水平和尿液中24 h UPro水平均顯著降低（P<0.05），而各給藥組血清中上述指標水平組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。各組大鼠血清中Scr、BUN水平和尿液中24 h UPro水平檢測結果見表1。

3.2 丹參多酚酸鹽對RIF模型大鼠腎臟病理組織學的影響

3.2.1 HE染色結果 病理取材時可見模型組大鼠腎臟代償性增大，表面存在凸起。HE染色結果顯示：正常組大鼠腎小管結構排列整齊，腎小球形態規則，無系膜增生，間質正常，未見炎性細胞浸潤;模型組大鼠可見系膜增生，腎小管擴張或萎縮，腎小球硬化且形態不規則，球囊粘連，纖維化組織增多，間質增寬，可見炎性細胞浸潤;丹參多酚酸鹽低、高劑量組和氯沙坦組大鼠腎小管擴張或萎縮減輕，炎性細胞減少。與正常組比較，模型組大鼠腎小管損傷評分、腎小球硬化評分均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠腎小管損傷評分、腎小球硬化評分均顯著下降（P<0.05），而各給藥組上述指標評分組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。各組大鼠腎組織HE染色顯微圖見圖1，腎小管損傷評分、腎小球硬化評分結果見表2。

3.2.2 Masson染色結果 正常組大鼠腎間質可見少量纖維化;模型組大鼠腎間質纖維化程度明顯增加;氯沙坦組和丹參多酚酸鹽低、高劑量組大鼠腎間質纖維化程度均較模型組明顯改善。與正常組比較，模型組大鼠腎組織陽性染色面積百分比顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織陽性染色面積百分比均顯著降低（P<0.05）。與氯沙坦組比較，丹參多酚酸鹽低劑量組大鼠腎組織陽性染色面積百分比差異無統計學意義（P>0.05），但丹參多酚酸鹽高劑量組大鼠腎組織陽性染色面積百分比顯著降低（P<0.05）。與丹參多酚酸鹽低劑量組比較，丹參多酚酸鹽高劑量組大鼠腎組織陽性染色面積百分比顯著降低（P<0.05）。各組大鼠腎組織Masson染色顯微圖見圖2，陽性染色面積百分比檢測結果見表2。

3.3 丹參多酚酸鹽對RIF模型大鼠腎組織中Wnt5a、Wnt5b、β-catenin蛋白表達的影響

3.3.1 免疫組化檢測結果 與正常組比較，模型組大鼠腎組織中有大量Wnt5a、β-catenin蛋白沉積，其IOD值均顯著升高（P<0.05）;有少量Wnt5b蛋白沉積，其IOD值顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中Wnt5a、β-catenin蛋白沉積減少，其IOD值均顯著降低（P<0.05）;Wnt5b蛋白沉積增多，其IOD值均顯著升高（P<0.05）。與氯沙坦組比較，丹參多酚酸鹽低劑量組大鼠各蛋白沉積無明顯變化，其IOD值差異均無統計學意義（P>0.05）;但丹參多酚酸鹽高劑量組大鼠腎組織中Wnt5b蛋白沉積減少，其IOD值顯著降低（P<0.05）。與丹參多酚酸鹽低劑量組比較，丹參多酚酸鹽高劑量組大鼠腎組織中有少量β-catenin蛋白沉積，其IOD值顯著降低（P<0.05）。各組大鼠腎組織中Wnt5a、Wnt5b、β-catenin蛋白表達的免疫組化染色圖見圖3，IOD值檢測結果見表3。

3.3.2 Western blot檢測結果 與正常組比較，模型組大鼠腎組織中Wnt5a、β-catenin蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），Wnt5b蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中Wnt5a、β-catenin蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），Wnt5b蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。與氯沙坦組比較，丹參多酚酸鹽低劑量組大鼠腎組織中各蛋白表達水平差異均無統計學意義（P>0.05），但丹參多酚酸鹽高劑量組大鼠腎組織中Wnt5a蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。與丹參多酚酸鹽低劑量組比較，丹參多酚酸鹽高劑量組大鼠腎組織中β-catenin蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。各組大鼠腎組織中Wnt5a、Wnt5b、β-catenin蛋白表達的電泳圖見圖4，表達水平檢測結果見表4。

4 討論

RIF是慢性腎病的共同特征之一，其主要特征是肌纖維母細胞浸潤和細胞外基質的過度沉積，常會導致腎功能喪失[9]。腺嘌呤是嘌呤類含氮雜環化合物，主要用于化療藥物引起的白細胞減少癥的治療[10]。在黃嘌呤氧化酶作用下，腺嘌呤可生成2，8-二羥基腺嘌呤而使腎小管堵塞，導致氮質化合物排出受到影響，從而造成血清中Scr、BUN和尿酸水平升高。而血清中結晶的過飽和尿酸會在腎小管、間質及腎小球部位沉積形成異物，使腎局部發生肉芽腫性炎癥，引起大量腎單位損傷，最終引發RIF [11]。本研究采用腺嘌呤構建大鼠RIF模型，發現模型大鼠血清中Scr、BUN及尿液中24 h UPro水平均顯著升高，腎纖維化組織增多、間質增寬，表明造模成功。該模型由腺嘌呤化合物沉積于腎小管及間質引起，與臨床上腎后性梗阻形成的慢性腎衰類似[12]，可以用于RIF的研究。

丹參是唇形科植物丹參的干燥根及根莖，始載于《神農本草經》，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰之功效[13]。丹參多酚酸鹽是由從丹參中提取的多酚酸鹽類化合物，可依靠多途徑保護血管內皮細胞，且具有抗纖維化作用[14]。根據RIF中醫病機，并結合纖維化的臨床及病理特點，本課題組認為活血化瘀通絡能改善腎纖維化狀態，故選用丹參多酚酸鹽為治療藥物。氯沙坦鉀片是血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑類降壓藥，除能有效控制患者血壓、減少心血管并發癥外，還能降低尿蛋白水平及保護腎臟，且已有多篇腎纖維化研究文獻選擇其作為陽性對照藥物[15-16]，故本研究選用氯沙坦鉀片為陽性藥物。本研究結果顯示，丹參多酚酸鹽能降低RIF模型大鼠血清中Scr、BUN水平及尿液中24 h UPro水平，并使其腎臟纖維化組織和炎性細胞減少、腎小管擴張或萎縮減輕，表明丹參多酚酸鹽對RIF模型大鼠具有較好的改善作用，且丹參多酚酸鹽的作用具有一定的劑量依賴性趨勢。

Wnt/β-catenin信號通路因果蠅基因Wingless而得名，可以調控胚胎發育和細胞分化過程，是上皮間質轉化調控機制的主要通路之一[8-9]。Wnt/β-catenin信號通路在正常腎臟中處于沉默狀態，而當該通路相關蛋白表達增多時，腎臟纖維化的發生發展進程就會相對較快[9]。因此，可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化來延緩腎纖維化進程[9]。Wnt蛋白是由Wnt基因編碼的一種分泌型糖蛋白，也是Wnt/β-catenin信號途徑的重要因子，具有Wnt5a、Wnt5b等多個亞型[17-18]。其中，Wnt5a兼有誘導細胞分化成熟和異常激活Wnt/β-catenin信號途徑的功能，而Wnt5b則對Wnt/β-catenin信號途徑具有抑制作用[19]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號途徑的核心因子之一，其被活化后可在細胞中大量聚集，并與DNA親和蛋白LEF/TCF結合，激活CyclinD1、C-myc等靶基因，從而啟動細胞核中的細胞復制程序;此外，β-catenin還可與E-鈣黏蛋白結合形成復合體，從而促進細胞間黏附，當其表達缺失時，細胞間黏附作用將降低或喪失[20-22]。本研究結果顯示，RIF模型大鼠腎組織中Wnt5a、β-catenin蛋白表達上調，Wnt5b蛋白表達下調;而丹參多酚酸鹽可以顯著下調RIF模型大鼠腎組織中Wnt5a、β-catenin蛋白表達，上調Wnt5b蛋白表達，且其作用具有一定的劑量依賴性趨勢。

綜上所述，Wnt/β-catenin信號途徑在RIF模型大鼠腎組織中存在異常激活現象，而丹參多酚酸鹽可以通過下調Wnt5a、β-catenin蛋白的表達以及上調Wnt5b蛋白的表達來抑制該信號途徑的異常激活，從而發揮對RIF模型大鼠的改善作用，且在本研究劑量范圍內具有一定的劑量依賴性趨勢。以上研究為丹參多酚酸鹽在腎纖維化治療方面的深入開發利用提供了實驗依據，但其更多的作用機制仍需進一步探討。

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（收稿日期：2020-12-02 修回日期：2021-02-23）

（編輯：林 靜）