酶聯免疫法測量動物尿液中萊克多巴胺含量的不確定度分析

盧壽康，胡鳳霞，葉惠儀，邱詩婷

（廣東省東莞市萬江農業技術服務中心，廣東東莞 523000）

1 前言

酶聯免疫法（ELISA）是應用在動物尿液、組織或飼料中的萊克多巴胺（瘦肉精）檢測的一種快速篩選方式，隨著近年來萊克多巴胺酶聯免疫法試劑盒質量的提高，能夠定量或半定量測定樣品中萊克多巴胺含量。測量不確定度示表征測量值所處量值范圍內的參數，可以反映數據的不確定程度以及可信程度[1-2]，是與現有可利用知識相應的最佳值接近程度的一種估計。迪恩生物有限公司提供的質檢報告，校正曲線在0～8.1ng／mL范圍內精密度為CV為0.36%～5.37%。雖然該方法為萊克多巴胺的篩選方法，但鑒于能夠定量或半定量測定，研究者認為該方法測量結果準確性的影響因素有做合理分析的必要性，應該分析尋找主要影響因素并算出其所測結果的不確定度來對所測結果做準確可靠性評估。

萊克多巴胺是動物性食品中常有的激素類添加劑，近幾年我國進出口岸對入境口岸食品中的檢測多次測出萊克多巴胺。正常劑量的瘦肉精藥物進入動物體內后可以通過新陳代謝排出，但過量攝入后該激素類添加劑用于動物飼料中后在動物體內會有大部分激素殘留，不僅對動物機體有負面影響，對消費者的身體健康也有很大危害。

2 方法

2.1 試驗方法

將萊克多巴胺酶聯免疫試劑盒在22℃～25℃放置1h以上。豬尿樣以3000rmp/min的速度離心3min。向萊克多巴胺微孔板中加入50μL系列標準/豬尿樣品，立即向所有孔中加入100μL酶標工作液，輕輕晃動反應板幾秒鐘，在22℃～25℃孵育10min，倒出微孔中的液體。將所有微孔放入洗板機中洗板4次，每次每孔用250μL清洗液。將微孔板倒置在吸水紙上，拍干或用脫水儀脫水，加入100μL顯色劑，搖勻反應板，22℃～25℃顯色10min，最后加入100μL終止液。10min內在酶標儀450nm波長下測量吸光度值。

2.2 測定結果數學模型

式中：B為樣品在450nm下的吸光度；

B0為零標準在450nm的吸光度；

x為樣品中萊克多巴胺的濃度，μg/L；

a，b為線性曲線的擬合系數。

3 不確定度的來源分析

用魚骨圖表示如下：

3.1 移液器加樣引起的不確定度u（fv）

a.加入50μL標準溶液/樣品的不確定度；b.加入100μL酶標工作液的不確定度；c.溫度效應產生的不確定度；B類評定，按均勻分布。

3.2 試劑盒標準品的不確定度u（c）

在0～8.1ng／mL范圍內精密度為CV為0.36%～5.37%。包括廠家配液時使用的移液器、溶液溫度變化，標準物質的最大允許差所引起的不確定度；B類評定，按均勻分布。

3.3 試劑回收率引起的不確定度u（Rec）

通過迪恩生物有限公司樣品檢測限及回收率實驗（說明書介紹有數據）或本實驗室進行樣品檢測限及回收率實驗求得回收率；B類評定，按均勻分布。

3.4 酶標儀測定OD值u（f（A））產生的不確定度

依照校準證書，酶標儀在450nm測定范圍0.220-1.342A時，儀器的誤差分別為0.001、0.000A、-0.003A、0.000A；校準證書上顯示的測量結果的擴展不確定度U=0.02，k=2。

3.5 樣品重復測量的不確定度u（RSD）

使用3個梯度的加標樣品和1份豬尿樣品分別進行重復測量8次，A類評定，通過貝塞爾公式計算。

3.6 吸光度與濃度轉換引入的不確定度u（f（x））

經迪恩生物有限公司ELISA數據處理系統作出“相對吸光度——濃度對數”擬合曲線，求得擬合曲線的標準偏差（SD值），A類評定，通過最小二乘法計算。

4 不確定度分量的量化

4.1 移液器加樣造成的不確定度u（fv）

4.1.1 移液器容量誤差產生的標準不確定度u（P）。查JJG646-2006《移液器檢定規程》可調式移液器在50μL檢定點的容量允許誤差為±3%，按均勻分布計算，U（P50）在100μL檢定點的容量允許誤差為按均勻分布計算，

4.1.2 溫度效應造成的標準不確定度u（T）。按規定容量器皿的校準在20℃下進行，水的膨脹系數為 2.1×10-4/℃，假設實驗室的溫度在 23.5±1.5℃之間波動。由于溶液在不同溫度下，密度不一樣，體積也發生變化，根據溶液的種類及濃度從校正表中查出23.5℃水的補正值A，實際體積

按均勻分布，加樣為49.9655μL、99.931μL由溫度效應引入的標準不確定度為：

4.1.3 相對合成標準不確定度由于u（P）和u（T）相互獨立，故

整個實驗過程中分別有樣品50μL、酶標工作液100μL、顯色劑100μL和終止液100μL四步加樣步驟，四者分別是相互獨立的關系。

4.2 試劑盒標準品的不確定度u（c）

杭州迪恩生物有限公司提供的質檢報告給出的標準品濃度在0～8.1ng／mL范圍內精密度（相對標準偏差）CV為0.36%～5.37%），則u（c）=5.37%=0.0537。

4.3 試劑回收率u（Rec）引起的不確定度

浙江迪恩生物科技股份有限公司的提供的說明書，尿液樣品該試劑盒的回收率為90±20%，按均勻分布。則u

4.4 酶標儀測定OD值u（f（A））引起的不確定度

MULTISKANFC酶標儀在450nm的吸光度示值的最大允差為±0.03A，校準證書上顯示的測量結果的擴展不確定度

4.5 樣品重復測量的不確定度u（RSD）

使用3個梯度（1.1ppb、2.2ppb、5.5ppb）的加標樣品和1份豬尿樣品分別進行重復測量8次，并剔除認為無效的數據[6]。表1數據顯示，4個樣品測量的相對標準偏差RSD不大于15.1%。鑒于日常檢測中同一樣品做兩次平行測量，以2次測量的平均值作為被測量的估計值，

表1 樣品重復性測量結果

4.6 吸光度與濃度轉換u（f（x））引入的不確定度

使用杭州迪恩生物有限公司提供的ELISA數據處理系統，通過對6組試劑盒標準品重復測量2次，測得的吸光值，將所有標準品的B/B0在半對數系統里依次輸入，根據每個標準品對應的不同濃度，可以得出圖1的標準曲線，樣品的B/B0值在標準曲線中能找到對應的萊克多巴胺的濃度。通過分析得到萊克多巴胺的線性回歸方程，表示為Y=-0.1507X+0.4938，其中，斜率為-0.1507，截距為0.4938，相關系數｜R｜=0.9934，具有良好的線性相關性[7]。經ELISA數據處理系統通過最小二乘法求得曲線的SD值為0.13，

5 合成標準不確定度

不確定度分量列表于下：

萊克多巴胺相對合成不確定度：

當樣品中萊克多巴胺的濃度x為0.2123μg/L時，Ux=urel×x=0.1920×0.2123=0.0408μg/L

6 擴展不確定度

按照慣例，取擴展因子k=2，則擴展不確定度為Uk=Ux×k=0.0408μg/L×2=0.0816μg/L

7 結果報告

按照農業部1025公告-6-2008《動物性食品中萊克多巴胺殘留檢測酶聯免疫吸附法》，測定豬尿中萊克多巴胺的平均含量0.2123μg/L，Uk=0.0816μg/L，k=2。