煙草幼苗中煙堿轉化株的快速篩選

李 勇，逄 濤，陳學軍，師君麗，隋學藝，顧華國

云南省煙草農業科學研究院，云南省玉溪市南祥路14 號 653100

煙堿是栽培煙草（Nicotiana tabacum）的主要生物堿，約占栽培煙草生物堿總量的95%［1］。降煙堿是煙堿的去甲基化產物，在栽培煙草中含量較少，但在其祖先種絨毛狀煙草（Nicotiana tomentosiformis）［2］和 林 煙 草（Nicotiana sylvestris）［3］中含量較高，是這些煙草的主要生物堿。Siminszky 等［4］證實了煙堿向降煙堿的轉化由名為CYP82E47 的細胞色素P450 單氧化酶調節，而CYP82E47 則受葉片老化相關信號通道調節［5］。在栽培煙草中，煙堿向降煙堿的轉化主要發生在煙葉衰老和調制過程中。栽培煙草中可將大部分煙堿轉化為降煙堿的突變植株被稱為“轉化株”［6］。白肋煙和烤煙中關于轉化株的報道很多［7-8］。轉化株中煙堿含量很低，而降煙堿、N-亞硝基降煙堿（N-nitrosonornicotine，NNN）［9］和麥斯明［10-11］等含量則成倍上升，該變化可導致轉化株煙葉的評吸質量降低，致癌風險上升。在白肋煙群體中，最多可出現20%的轉化株［4］?？緹熮D化株被稱為“硃砂煙”或“櫻紅煙”［12］，烤煙群體中轉化株比例約為0.6%［13］。與白肋煙相比，正?？緹煹腘NN 含量較低（約為白肋煙的1%或更少），故烤煙轉化株中的NNN 濃度遠低于白肋煙和白肋煙轉化株。

從栽培煙草群體中識別和去除轉化株有利于保障生產煙葉的品質穩定。轉化株鑒別一般采用乙烯、乙烯利、碳酸氫鈉等激化劑促進轉化株的煙堿在較短時間內大量向降煙堿轉化，再通過測定煙堿和降煙堿的含量對轉化株進行判別［14-15］。然而這些方法多側重于檢測大田煙株，且鑒定通常需要幾天時間。從苗盤幼苗中快速篩除轉化株相比大田期篩除更為高效，但目前相關方法還未見報道。為此，本研究中擬通過對煙草幼苗期轉化株和非轉化株生物堿含量特征的研究，旨在建立一種對苗盤幼苗煙草轉化株的快速鑒定方法。

1 材料和方法

1.1 育苗和采樣

將云煙85（烤煙）、云煙85 轉化株（烤煙）、TN90（白肋煙）和克撒錫巴斯瑪（香料煙）等煙草種子播種在溫室中各自的苗盤（9×18 孔，孔徑：3 cm×3 cm）內。播種后第45～55 d 進行取樣。對于每一株幼苗，取其最大葉片（長寬乘積大于40 cm2）。將采集的葉片沿主脈對折，然后再對折。采用直徑為6 mm 的打孔器在折后煙葉上進行3 次打孔（打孔時盡量使3 個孔在折后煙葉上分布均勻），收集12 個直徑為6 mm 的圓形葉塊，放入1.5 mL塑料離心管中。采集的樣品可直接進行溶劑提取或在37 ℃下孵化12 h 后進行溶劑提取。為防止種子自然突變現象對實驗的影響，所有實驗煙苗均采用基于Shi 方法［14］的程序進行孵化，即樣品在37 ℃和80%相對濕度下孵育7 d，然后取出進行分析，確定其是否為轉化株。

1.2 生物堿提取

采用甲基叔丁基醚（Methyl tert-butyl ether，MTBE）作提取劑，喹啉作內標。每個幼苗樣品中同時加入0.3 mL 喹啉溶液（溶劑為MTBE）和0.5 mL 2.5%（質量分數）的氫氧化鈉溶液，渦旋1 min，萃取液靜置分層，取150 μL 上清液轉移至氣相色譜自動進樣器進樣小瓶進行儀器分析。

1.3 儀器分析

采用Agilent 7890A 氣相色譜儀（美國Agilent公司）與5977B 質譜儀進行分析。色譜柱為DB-5 MS 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。分流比為20∶1，進樣量為2 μL。分離溫度為270 ℃恒溫，分離時間為1.8 min，每個樣品儀器總運行時間約3.5 min。載氣（氦氣）流量為1.0 mL/min。采用選擇離子模式（SIM）進行數據采集。煙堿、降煙堿和喹啉的分析離子分別設為84、70 和129。采用電子轟擊（EI）模式電離，電離電壓為70 eV，檢測器電壓為1.0 kV。離子源和傳輸線溫度分別保持在200 ℃和300 ℃。

1.4 數據分析

使用Agilent MSD ChemStation F.01.03.2357 化學工作站對所有樣品和標準品進行自動峰識別和積分。手動檢查積分錯誤并在必要時重新積分。用于校正曲線的煙堿和降煙堿的濃度范圍分別為0.78～50.00 μg/mL 和0.15～10.00 μg/mL。內標（喹啉）濃度為1.0 μg/mL。使用MSD 化學工作站完成定量校準，并將所得數據轉移到Excel 軟件中進行進一步分析。用煙堿轉化百分比（Percent nicotine conversion，PNC）區分轉化株和非轉化株。PNC 定義為降煙堿濃度（mol/L）除以煙堿和降煙堿總濃度（mol/L）的商。為簡化篩選轉化株的流程，本實驗中還定義了擬PNC（Pseudo percent nicotine conversion，PPNC）。PPNC 定義為降煙堿峰面積除以煙堿和降煙堿總峰面積的商。使用PPNC 時無需使用煙堿和降煙堿的標準品，也無需繪制標準曲線。實驗中涉及的煙葉質量均為鮮煙葉的質量。

2 結果與分析

2.1 采樣穩定性實驗

為實現轉化株的快速篩選，本實驗中在采樣時省略了稱樣步驟。評價了所采樣品質量的穩定性（表1），發現不同煙葉10 個樣品之間的質量相對標準偏差在4.1%～4.8%之間，表明所使用的采樣方法可以采集質量較為穩定的樣品。其原因可能為苗盤煙苗所處的生長環境幾乎完全相同，所采葉片具有相似的厚度和密度。樣品質量的穩定性確保了所計算的PNC 或PPNC 的可比性。由于大田煙葉所處生長環境差異較大，如采用本實驗使用的方法采樣可能導致不同樣本間的質量差異較大。但由于PNC 或PPNC 的計算與采樣質量無關，只要煙堿和降煙堿的濃度處于儀器的線性響應范圍，采樣質量的差異不會對PNC 和PPNC 的計算值產生影響。

表1 打孔器取樣獲得樣品的質量分布Tab.1 Weight distribution of samples obtained by using hole punchers

2.2 葉片上采樣位置對分析結果的影響

為實現轉化株的快速篩選，本實驗中從幼苗葉片中收集12 個葉塊作為一個樣品，而不是把整片葉子或整個植物作為樣本采集。實驗結果（表2）表明，煙堿和降煙堿在幼苗葉邊緣的含量高于中間。而PNC 和PPNC 值在邊緣和中間采樣間無顯著差異。這表明葉片上的采樣位置對PNC 和PPNC 值影響不大。但仍建議對每片葉子進行固定位置采樣，在本實驗中對對折后煙葉進行打孔時，盡量使3 次打孔均勻分布于煙葉表面。

表2 葉面采樣位置對PNC 和PPNC 的影響①Tab.2 Influences of leaf sampling position on PNC and PPNC

2.3 葉片大小對分析結果的影響

對比分析了大葉采樣和小葉采樣對PNC 和PPNC 的影響（表3）。結果發現，煙堿和降煙堿的含量在大葉和小葉之間沒有顯著差異，PNC 和PPNC 的差異也不明顯?？紤]到對太小的煙葉采樣時操作較困難，建議選擇長寬積超過40 cm2的葉片進行采樣。

表3 葉面尺寸對PNC 和PPNC 的影響Tab.3 Influences of leaf size on PNC and PPNC

2.4 PNC 在未孵化幼苗中的分布

在不進行孵化培養的情況下直接測定轉化株和非轉化株中煙堿和降煙堿的含量并計算PNC。結果顯示，烤煙轉化株的煙堿含量低于非轉化株，而降煙堿的含量則高于非轉化株（表4）。這意味著在幼苗期，轉化株中的煙堿就已經開始向降煙堿轉化。對221 株烤煙轉化株和非轉化株群體進行分析，發現轉化株的PNC 均值為其非轉化株的4倍。這種差異表明可通過PNC 對幼苗轉化株進行區分。通過對轉化株和非轉化株中PNC 的分布（圖1b）進行研究發現，以PNC 值5%作篩選和去除轉化株的判斷點時，可以在損失7%的非轉化株的情況下去除99%的轉化株；以PNC 值4%作判斷點時，可以在損失21%的非轉化株的前提下完全去除轉化株。該方法雖有部分非轉化株損失，但可實現轉化株的快速篩除。

根據文獻［4，15］，白肋煙和香料煙群體中轉化株的最高比例分別可達20%和10%。由于未獲得白肋煙和香料煙的轉化株種子，本研究中嘗試使用Shi 等的方法［14］從這兩個品種的幼苗中篩選出轉化株作為實驗對象，但未成功。將白肋煙和香料煙的非轉化株與烤煙非轉化株進行比較（表4），發現白肋煙非轉化株與烤煙非轉化株具有相似的煙堿和降煙堿含量，因而其PNC 值也很接近。香料煙非轉化株的煙堿含量比烤煙非轉化株低，但降煙堿含量相當，因此導致香料煙非轉化株的PNC 值整體大于白肋煙和烤煙。預計白肋煙轉化株的PNC 值分布與烤煙轉化株相似，但這種推測需通過較大樣本量的白肋煙轉化株進行驗證。

2.5 PPNC 的使用

由于PNC 是根據煙堿和降煙堿的絕對定量計算得出的，PNC 的值受標準品純度和校準曲線質量的影響。為簡化判別并消除潛在誤差，本實驗中定義了PPNC。對PNC 和PPNC 進行線性擬合，發現兩者存在顯著的線性相關（R2=0.996 8，圖1a）。比較PNC 和PPNC 對烤煙轉化株和非轉化株群體（轉化株和非轉化株分別為106 株和154株）的區分，發現轉化株的PNC 和PPNC 分別為非轉化株的3.8 倍和4.5 倍（表4）。進一步考察兩者對轉化株的區分效果（圖1b、圖1c），發現根據PPNC 值0.9%對轉化株進行篩選，可在損失8%非轉化株的情況下實現轉化株的完全剔除。而采用PNC 值進行判別時，要達到轉化株的完全剔除，需損失21%的非轉化株。因此，本研究中PPNC 的計算比PNC 更簡單，且用于轉化株篩除時效果更佳。

圖1 PNC 和PPNC 之間的相關關系以及兩者在轉化株和非轉化株中的數值分布Fig.1 Distribution and correlation of PNC and PPNC in converters and non-converters

表4 轉化株和非轉化株的PNC 和PPNC 值分布Tab.4 Distribution of PNC and PPNC in converters and non-converters

2.6 孵化煙葉以實現轉化株和非轉化株的完全分離

從烤煙群體中轉化株（106 株）和非轉化株（154 株）的PNC 分布可知，即使兩者的PNC 均值差異很大，轉化株和非轉化株群體之間仍存在PNC 或PPNC 重疊的現象（圖1b、圖1c）。采用未孵化煙葉的PNC 或PPNC 進行轉化株的篩選時，要么需損失篩選的準確性，要么需損失部分非轉化株煙苗。而文獻報道的轉化株篩選方法，均采用激化劑（乙烯、乙烯利或碳酸氫鈉）對煙苗進行孵化培養，以擴大轉化株和非轉化株之間的PNC 差異［14-15］。這些方法均需在合適激化劑存在并控制溫度和濕度培養幾天方可實現。本實驗中發現，在37 ℃下孵化所采集的煙葉樣品（密封于1.5 mL離心管中）12 h 后，轉化株的PNC 和PPNC 分別增加了3.1 倍和3.7 倍，而非轉化株的PNC 和PPNC 均沒有顯著變化（圖2a、圖2b）。孵化實驗促進了轉化株中煙堿向降煙堿的轉化，使得轉化株群體和非轉化株群體的PNC 或PPNC 不再有重疊（圖2c、圖2d）。因此，如果不要求對轉化株進行現場即時篩選，可將所采集的樣品在37 ℃下培育12 h 后再進行溶劑提取和儀器分析。

圖2 孵化對區分轉化株和非轉化株的影響Fig.2 Influences of incubation on discrimination of converters and non-converters

3 討論

Shi 等［14］優化了轉化株的孵化條件（包括溫度、相對濕度和激化劑），以實現煙堿的最大轉化，然后根據最大轉化率篩選轉化株。該方法中孵化反應耗時4～6 d，測定煙堿和降煙堿的含量再需幾個小時，雖然有效但較為費時，故不太適合大規模煙株樣本的篩查。本實驗中發現，未經孵化培養的幼苗轉化株的平均PNC 和PPNC 分別為非轉化株的3.8 和4.5 倍。采用PPNC 進行篩查時可在只損失8%非轉化株的前提下實現轉化株的完全剔除。因此，如需快速篩查，可采用不孵化培養的方式進行篩選。

本實驗中簡化了煙堿和降煙堿的測定方法，取消樣品研磨和稱樣步驟，縮短了樣品提取時間，優化了氣質聯用分析方法（采用270 ℃恒溫模式而不是程序升溫），最終使得整個鑒定過程只需5～6 min（圖3，方法A）。若需完全分離轉化株和非轉化株，只需要在樣品提取之前將采集的樣品在37 ℃下孵育12 h 即可（圖3，方法B）。此外，本實驗中引入了PPNC 作為PNC 的簡化方案。PPNC 比PNC 更容易獲得，且不受標準品純度、標準曲線質量等因素影響，一定程度上比PNC 具有更好的篩選效果。

圖3 直接鑒定煙堿轉化株（方法A）和孵育后鑒定轉化株（方法B）的流程圖Fig.3 Flow charts of direct identification of nicotine converters（A）and identification after incubation（B）

文獻［14］中使用了包括乙烯，乙烯利和碳酸氫鈉等刺激劑促進煙堿轉化，而碳酸鈉被認為與乙烯和乙烯利具有相同的刺激效果。本實驗中比較了使用和不使用0.8%碳酸氫鈉處理的轉化株幼苗，發現2 種處理的PNC 無明顯差異，這可能與本實驗在封閉系統里進行孵化處理有關。因此，本實驗中在進行孵化培養時無需外加激化劑。

根據Shi 等［14］的方法，為實現煙堿的最大轉化需控制相對濕度，適當的濕度可確保轉化相關酶的活性。本實驗中將葉片樣品密封在1.5 mL 離心管中進行孵育，葉片的水分被封鎖在離心管中，因此無需提供額外的環境濕度。采用這種方法，轉化株的PNC 和PPNC 分別增加了3.1 倍和3.7 倍（圖2a、圖2b），而非轉化株則沒有變化。由于本實驗中無需額外控制孵化反應的濕度，簡化了反應條件，使得孵化反應可在任何溫度可控的環境下進行。

4 結論

本研究中建立了一種快速鑒定煙草幼苗群體中煙堿轉化株的方法，該方法采用打孔器取樣，樣品無需研磨，直接提?。ɑ蛎芊馀囵B后提?。┖筮M行氣相色譜-質譜快速分析，可在幾分鐘或十幾個小時內完成轉化株的篩除，為大批量快速篩查煙草幼苗中的煙堿轉化株提供了技術方案。