豨薟精醇對免疫性血小板減少癥的網絡藥理學與實驗研究

徐麗偉，周凱旋，薛嘉寶，辛 國，李麗靜*

（1.長春中醫藥大學附屬醫院，長春130021；2.長春中醫藥大學，長春130117）

免疫性血小板減少癥（ITP）是一種由于血小板自身免疫性破壞，外周血中血小板減少的自身免疫性出血性綜合征[1]，主要臨床表現為皮膚黏膜瘀點、瘀斑、月經量多、尿血，嚴重者可因顱內出血而危及生命[2]，在臨床上常用地塞米松進行治療，抑制患者免疫功能，恢復細胞亞群間的平衡[3]。豨薟草是菊科植物豨薟（Siegesbeckia orientalis L）、腺梗豨薟（Siegesbeckia pubescens Makino）和毛梗豨薟（Siegesbeckia glabrescens Makino）的干燥地上部分，性寒，味辛、苦，歸肝、腎經，可利關節、抗血栓、解毒、祛風濕等[4]，研究顯示，豨薟草對關節腫痛具有良好的治療作用，具有一定的免疫抑制作用[5]，豨薟精醇是豨薟草中的有效成分[6]，在實驗研究中，發現其具有一定的抗炎、調節免疫的作用[7]。本文通過網絡藥理學的方法，構建化合物-靶點-疾病網絡，分析豨薟精醇對免疫性血小板減少癥的作用及作用機制，并通過細胞實驗對其作用進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 豨薟精醇靶點預測

通過Pubchem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索豨薟精醇的化合物結構，復制Isomeric SMILES號至SwissTargetPrediction數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）進行靶點預測。

1.2 ITP靶點獲得

使用GeneCards數據庫（https://www.genecards.org）以“Immune Thrombocytopenia”為關鍵詞對疾病的靶點進行檢索，并使用Uniprot數據庫（https://www.uniprot.org/）對靶點進行蛋白標準化。

1.3 化合物-靶點-疾病網絡的構建

應用Cytoscape3.5.0軟件，將共有靶點基因導入，繪制化合物-靶點-疾病互作網絡圖并對共有靶點基因進行匯總。

1.4 基因富集分析

利用DAVID6.8數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）對上述篩選出的共有靶點進行基因本體（Gene ontology,GO）生物過程分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)通路富集分析。并選取前20個基因，使用易漢博生物信息在線作圖（www.ehbio.com）進行氣泡圖的繪制。

1.5 蛋白質相互作用網絡和關鍵靶點的獲取

運用STRING數據庫（https://string-db.org/），將共有靶點基因導入，對Organism限定為homo sapiens，進行蛋白質相互作用分析，并選取三個參數（Degree、Betweenness和Closeness），設定條件為Degree大于中位數的2倍，Betweenness和Closeness大于中位數，所獲得的靶點為關鍵靶點蛋白。

1.6 豨薟精醇對刀豆蛋白誘導的脾細胞影響

1.6.1 動物

SPF級雄性Balb/C小鼠，體重為18～22g，6～8周齡，購于遼寧長生實驗動物技術有限公司，合格證號:SCXK(遼)-2020-0001。

1.6.2 試劑與儀器

豨薟精醇 （B21355，上海源葉生物科技有限公司）；刀豆蛋白A（ConA）（C8110，北京索萊寶科技有限公司）；RPMI 1640培養液（31800，北京索萊寶科技有限公司）CCK-8試劑盒（KR675，同仁化學研究所）；胎牛血清（1861242，購于Gibco）；二氧化碳培養箱（311，ThermoFisher）；酶標儀（EPOCH，Bio-Tek）。

1.6.3 脾細胞的制備

小鼠斷頸椎處死，超凈臺中無菌取脾臟。取出的脾臟用D-Hank's液沖洗3次，在D-Hank's液的培養皿中，用5 mL注射器柄研磨脾臟，使用200目的鋼篩過濾，1000 rpm離心5 min，棄上清，加入紅細胞裂解液靜置3min，去除血紅細胞，D-Hank's洗3次，離心棄上清，含10%胎牛血清RPMI 1640培養液重懸。

1.6.4 脾細胞增殖活性檢測

在96孔板接種脾細胞懸液，細胞數量5000/孔，并將細胞分為正常組 （10%胎牛血清的RPMI1640完全培養液），模型組 （5mg/L的ConA+10%胎牛血清的RPMI1640完全培養液），豨薟精醇低劑量組（5mg/L的ConA+10μmol/L豨薟精醇+10%胎牛血清的RPMI1640完全培養液），豨薟精醇高劑量組 （5mg/L的ConA+20μmol/L豨薟精醇+10%胎牛血清的RPMI1640完全培養液）。每組5個復孔，37℃、5%CO2細胞培養箱中培養48h后，每孔加入10μL的CCK-8試劑，繼續培養1h后，用酶標儀檢測各孔450nm處的吸光值。

1.6.5 統計學方法

實驗數據采用SPSS 21.0軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（）表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 靶點收集結果與網絡構建

通過對豨薟精醇進行預測，共獲得靶點112個，收集獲得ITP相關靶點3759個，通過構建化合物-靶點-疾病網絡，獲得共有靶點56個，詳見圖1。

圖1 豨薟精醇與ITP網絡圖

2.2 GO生物學過程分析

在DAVID6.8數據庫對豨薟精醇和ITP共有的靶點基因進行GO生物學過程分析，結果以P值升序排列，取前20個條目，進行分析繪制氣泡圖，豨薟精醇治療ITP的生物學過程主要涉及調節多個蛋白通路的磷酸化、調節一氧化氮的合成、調控JAK-STAT級聯、調控細胞的增殖凋亡和遷移等，詳見圖2。

2.3 KEGG通路分析

對豨薟精醇和ITP共有的靶點基因進行KEGG通路富集分析，結果以P值升序排列，取前20個條目進行分析，繪制KEGG通路富集分析氣泡圖，豨薟草治療ITP的通路主要涉及癌癥的途徑、催乳素信號通路、PI3K-Akt信號通路、ErbB信號通路、膠質瘤、白細胞跨內皮遷移、FoxO信號通路、GnRH信號通路等，詳見圖3。

圖3 豨薟精醇和ITP的KEGG通路分析

2.4 蛋白質相互作用網絡及關鍵靶點

在STRING數據庫導入獲得的56個共有靶點基因，得到蛋白質相互作用網絡，詳見圖4，通過對蛋白質相互作用網絡進行分析，獲得5個作用網絡的關鍵靶 點 ， 分 別 為STAT3、EGFR、ESR1、HSP90AA1、MAPK8，詳見表1。

圖4 共有靶點蛋白質相互作用網絡

表1 關鍵靶點蛋白

2.5 豨薟精醇對脾細胞增殖的影響

使用ConA誘導脾細胞后，相較于正常組，模型組對脾細胞有顯著的增殖作用（P＜0.01），而加入豨薟精醇后，與模型組比較，豨薟精醇對ConA誘導的脾細胞增殖具有一定的抑制作用，且抑制作用與給藥劑量呈現一定的正相關性（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表2 豨薟精醇對脾細胞增殖的影響（n=5,x±s）

3 討論

通過網絡藥理學對豨薟精醇在ITP的治療機制進行研究，發現其機制涉及到多個方面，具有多靶點，多通路的特點。富集分析結果表明，豨薟精醇可通過影響蛋白質的磷酸化，進而調節機體的細胞的增殖、凋亡、遷移，并對一氧化氮的合成具有調節作用，一氧化氮對平滑肌細胞增生、血管張力、細胞免疫、細胞毒等具有調節作用[8]。發揮這些作用涉及了多條通路，催乳素是一種垂體肽激素，通過它可以對細胞增殖、分化和細胞存活產生影響進而調節多種生理功能[9]，ITP中可以通過調節PI3K-Akt信號通路，控制mTOR來進行血小板自噬的調控，研究表明，增強血小板自噬功能可減輕血小板破壞[10]，活化的Akt可使FoxO蛋白受到抑制，調節FoxO信號通路，進而調控Treg細胞的增殖，在ITP的治療中具有重要作用[11]。在關鍵靶點中，處于第一位的STAT3在免疫細胞中，活化的STAT3可導致免疫介質的抑制和免疫抑制因子的促進[12]，對ITP的治療具有積極的意義，表皮生長因子受體（EGFR）在免疫過程中有著重要作用，通過調節EGFR的表達[13]，對ITP的治療同樣具有積極的意義MAPK8在治療免疫相關疾病中同樣具有積極的作用，通過調節該靶點，進而可以調節Th1、Th2細胞和巨噬細胞[14]，發揮治療作用。脾臟是免疫應答的重要場所和重要調節器官，含有多種免疫細胞與細胞因子，主要的免疫細胞是淋巴細胞[15]，在臨床中，ITP患者常有脾臟增生的表現，可采用脾部分切除的方法進行治療[16]，細胞實驗顯示，豨薟精醇對ConA誘導的脾細胞增殖具有一定的抑制作用，表明了其在臨床應用上的潛力。

綜上所述，豨薟精醇對ITP的治療是通過影響多個生理過程來發揮治療作用的，本研究通過網絡藥理學的方法，探究了豨薟精醇對ITP治療的作用機制，為后續深入實驗研究提供了較為可靠的理論基礎。