丹紅化瘀口服液中丹參素鈉及柚皮苷質量研究

馮月娥 唐 清 匡艷輝＊ 張傳平

(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東 廣州510515)

丹紅化瘀口服液由成都中醫藥大學陳達夫教授根據王清任的“血府逐瘀湯”加減化裁研制而成，現行標準收載于2015年版《中國藥典》一部，為廣州白云山和記黃埔中藥有限公司的獨家品種，由丹參、當歸、川芎、桃仁、紅花、柴胡、枳殼7味藥組成的復方制劑。7味藥配伍使用，具有活血化瘀，行氣通絡的功效；用于氣滯血瘀引起的視物不清、突然不見癥，視網膜中央靜脈阻塞癥的吸收期見上述證候者[1-3]。

經查閱相關文獻，丹紅化瘀口服液對糖尿病并發的視網膜病變有較好的保護作用，近幾年對其研究集中于臨床應用方面[3-7]，而無檢索出對其質量控制研究，目前對于丹紅化瘀口服液質量標準的研究基礎較為薄弱。通過本課題組前期藥效學研究，在大鼠血漿中得到丹紅化瘀口服液的外源性化合物，其中主要為丹參中丹參素鈉等酚酸類和枳殼中柚皮苷、新橙皮苷等黃酮類兩大類指標，他們可能是復方潛在真正的活性成分。

目前，該制劑的質量控制方法主要為對薄層色譜法鑒別和原兒茶醛的含量測定[1]，而通過前期試驗數據分析得出，原兒茶醛在該制劑中極不穩定，在藥品有效期內降解較快，不適宜作為質量指標；另有學者研究柑橘屬中很多植物果中均含有柚皮苷，但是不含有新橙皮苷，不能準確判定枳殼質量[8]。因此，本文采用HPLC法對制劑中丹參素鈉、柚皮苷含量進行測定，提高了質量可控性，為其質量標準提高提供依據。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀：Dionex UltiMate 3000（美國戴安公司）、Waters 2695（美國沃特世公司）；色譜柱：WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）、Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）、Aglient Eclipse Plus C18。對照品丹參素鈉（批號：5781，純度97.5%）、柚皮苷（批號：5562，純度96.0%）均購自上海詩丹德標準技術服務有限公司。色譜甲醇、乙腈購自默克（德國）制藥公司；屈臣氏飲用水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司；其他試劑均為分析純。丹紅化瘀口服液（批號為B19A001、B19A005、A19A002、D17A003、I19A007、K1 9A003、K19A004）均由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

丹參素鈉：采用WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，以甲醇-0.5%甲酸水溶液（8∶92）為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長281 nm，柱溫為常溫，進樣量10μL。

柚皮苷：采用Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，以乙腈-0.4%磷酸水溶液（18∶82）為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長284 nm，柱溫為常溫，進樣量10μL。

2.2 對照品溶液制備

丹參素鈉：取丹參素鈉適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1 ml含0.560 2 mg的溶液，即得。

柚皮苷：取柚皮苷適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1 ml含0.2 284 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備

精密量取本品1 mL置于10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，使每1 mL溶液中含有0.1 mL本品，搖勻，經0.22μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液制備

按丹紅化瘀口服液處方要求，分別制備不含丹參的陰性樣品、不含枳殼的陰性樣品，按“2.3”項下方法分別制備丹參陰性對照溶液、枳殼陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、丹參陰性對照溶液、枳殼陰性對照溶液各10μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（見圖1）。結果顯示，分離度良好，丹紅化瘀口服液中其他成分對2種指標成分的測定無干擾專屬性良好。

圖1 丹紅化瘀口服液中2種成分HPLC圖

2.6 線性關系考察

分別精密吸取“2.2”項下的對照品溶液0.5μL、1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、15μl，注入液相色譜儀中，按“2.1”的色譜條件測定。以進樣量（μg）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪圖得丹參素鈉、柚皮苷回歸方程，結果見表1。

表1 2種成分線性關系考察結果

2.7 耐用性試驗

根據預實驗，分別用Dionex UltiMate 3000、Waters 2695高效液相色譜儀和WondaSil C18、Aglient Eclipse Plus C18、Diamonsil C18不同型號的色譜柱對供試品溶液進樣分析，結果表明不同儀器和色譜柱分離效果均無明顯差異，系統耐用性良好。

2.8 精密度試驗

取“2.3”項下制備的供試品溶液，按“2.1”的色譜條件，連續6次進樣，結果丹參素鈉、柚皮苷峰面積的RSD分別為0.83%、0.23%，表明方法精密度良好。

2.9 重復性試驗

取同一份樣品，按“2.3”項下平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項下的色譜條件測定，結果丹參素鈉、柚皮苷平均含量的RSD分別為0.87%、0.83%，表明該方法重復性良好。

2.10 穩定性試驗

取“2.3”項下制備的供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h、48 h進樣，按“2.1”的色譜條件測定，記錄峰面積，結果丹參素鈉、柚皮苷峰面積的RSD分別為3.15%、1.33%，表明該方法穩定性良好。

2.11 加樣回收率試驗

取已知含量同一批丹紅化瘀口服液共6份，分別精密加入適量對照品溶液，按“2.3”項下制備的供試品溶液，按“2.1”的色譜條件測定，計算丹參素鈉、柚皮苷的回收率。結果丹參素鈉、柚皮苷的平均回收率分別為95.07%、105.11%，RSD分別為0.74%、0.88%，（n=6）。結果見表2，表明該方法的準確度良好。

表2 丹紅化瘀口服液中2種成分加樣回收率試驗結果

2.12 樣品含量測定

取丹紅化瘀口服液樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算樣品中丹參素鈉、柚皮苷含量，結果見表3。

表3 丹紅化瘀口服液中2種成分含量

3 討論

3.1 指標成分選擇

中藥制劑組分較多，其制備工藝繁雜，使其質量難以得到較好的控制[9-10]。2015版《中國藥典》對丹紅化瘀口服液含量檢查為原兒茶醛，但通過前期實驗發現原兒茶醛在儲存期間，含量不穩定，呈下降趨勢，時間越久，含量越低；另外，前期藥效學研究發現，丹紅化瘀口服液中主要的藥效成分為丹參素鈉等酚酸類和柚皮苷等黃酮類兩大指標性成分。因此，選擇丹參素鈉和柚皮苷作為丹紅化瘀口服液指標性成分進行分析。

3.2 提取劑的選擇

根據預實驗，分別對不同溶劑（水、甲醇、80%甲醇、乙醇）進行考察，綜合考慮所得色譜峰的峰面積、分離度、峰形和供試品制備時溶液是否產生絮狀物沉淀等方面，最終確定80%甲醇為提取溶劑。

3.3 檢測波長的選擇

根據不同成分在紫外光下的吸收情況，本實驗選擇最大吸收波長以避免其他物質干擾，保證測定準確性，最終確定丹參素鈉和柚皮苷檢測波長分別為281 nm（丹參素鈉）、284 nm（柚皮苷），此時色譜峰分離度、峰形理想，可用于定量分析。

3.4 流動相的選擇

本次研究為單一成分定量考察，考慮到梯度洗脫比等度洗脫方法的建立和日常應用更為復雜、困難，基線容易發生漂移等，選擇了等度洗脫。通過考察了不同比例甲醇/乙腈-磷酸水/甲酸水緩沖液系統，最終丹參素鈉、柚皮苷分別選擇甲醇-0.5%甲酸溶液（8∶92）、乙腈-0.4%磷酸水（18∶82）作為流動相，此時色譜峰分離度、峰形均良好。

4 結語

本實驗建立了HPLC法測定丹紅化瘀口服液中丹參素鈉、柚皮苷的含有量，該方法簡便快捷、重復性好、準確度高，能夠有效地提高丹紅化瘀口服液質量可控性，建議用于丹紅化瘀口服液的含量測定，為其質量標準提高和完善提供科學依據。