短小芽孢桿菌HR10產孢培養基及發酵條件優化

王朝恩， 劉婉慧， 陸藍翔， 付歡歡， 石慧敏， 史紀武， 葉建仁

(南京林業大學 南方現代林業協同創新中心 林學院，江蘇 南京 210037)

隨著我國森林綠化面積地不斷擴大，人工林栽植面積逐年增加[1]，在人工林的培育過程中，簡單追求高產出，長時間過度使用化學肥料，造成土壤板結，破壞土壤結構，引起土壤養分失衡，進而引發樹木生長不良，病害問題突出[2-4]。尋找有效提高土壤肥力、促進林木生長的方法，成為近年來研究的熱點。陳延熙根據微生態學理論(Microecology)提出了“植物微生態學”的概念，即任何植物個體都是其組織細胞與其體內微生物組成的復合體[5]，其原理是利用菌株搶占生態位[6]，調節植物喜好的酸堿環境[7]，建立生物屏障阻止有害微生物入侵，并刺激植物或者自身產生有益物質促進植物生長[8]，提高植物抗病能力[6-9]。近些年微生物菌劑的研究逐漸深入，大量有益微生物得到推廣和應用并取得了良好效果，如唐旭[10]在一年生黑松、馬尾松和濕地松上施用解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) JK-AH7，促生效果明顯。果樹作為特種經濟林具有較高的經濟價值，常年單一樹種種植，管理不當可能導致病原菌積累，在不利的環境下可能引起病害導致果樹樹勢衰弱，果品質量下降，帶來嚴重的生態危害和經濟損失[11-12]，如由葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)引起的蘋果輪紋病、葉斑病[13]，藍莓的枯死病和潰瘍病等[14]。楊星[15]在美國薄殼山核桃上施用多種有益微生物，表明合適的微生物菌劑可以有效提高植物光合作用，促進果樹生長，增強樹勢。竇承陽等[16]在梨樹上施用水拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis) JZ-GX1顯著增加了梨樹的地徑，提升了葉片生理指標，增加了土壤有效磷含量，平衡了土壤養分，提升了果實品質。大量研究結果表明有益微生物可以有效促進植物生長，提高植物抗病能力。傳統的有益微生物的施用形式多為液體[10,15-16]，存在運輸成本高、儲存時間短、存活率低等缺點，而固體菌劑因其體積小、貨期長、活性高等優點受到了廣泛關注。固體菌劑在制備過程中過低的存活率一直是研究的一大難點，芽孢(endospore)因其含水量極低，抗逆性強，能經受高溫、紫外線、電離輻射以及多種化學物質滅殺等特性[17-18]，在制備固體菌劑的研究中成為重要的一環[19]。已經有大量學者使用優化的培養基提高產孢率，如吳海霞等[20]對海洋解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)GM-1-1產孢培養基進行優化，細菌總數和芽孢率分別達7.40×109cfu/mL和89.42%，芽孢率的提高可以有效提升益生菌的生存能力及產品的穩定性，為其工業化生產提供廣闊的前景。短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)HR10是本重點實驗室在黑松-黃色須腹菌(Rhizopogenluteous, Rl)菌根根際土壤中分離得到的一株菌根輔助細菌(Mycorrhiza helper bacteria, MHB)，屬于芽孢桿菌屬，革蘭陽性，是一類嚴格需氧或者兼性厭氧、能夠形成內生孢子的芽孢桿菌[21]。盛江梅等[22]對其離體互作試驗結果表明，菌株HR10的菌體及胞外代謝產物均可有效提高Rl菌絲的生長，其菌體對Rl菌絲生長的增長率達到13.1%。盆栽試驗表明，HR10菌株與Rl雙接種黑松幼苗后，對松苗生長有顯著地促進作用，還有效提高了根系的菌根侵染率。單接種HR10實驗表明對黑松也有良好地促生效果。侯亮亮等[23]在將菌株HR10與苗木猝倒病病原絲核菌(Rhizoctoniasp.)離體平板對抗培養中發現其對病原菌有較為明顯地抑制作用，抑菌率達85.58%。松苗活體實驗中菌株HR10的發病率和病死率顯著低于對照組，說明該菌株是一株優良的生防菌，應用潛力巨大。本研究通過對菌株HR10進行碳源、氮源、無機鹽的篩選并研究其最佳的培養條件，以達到提高芽孢率，增加產品活性，降低成本的目的，為其日后的工業化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)HR10菌株由南京林業大學森林病理實驗室提供，該菌株同時也保存于中國典型培養物保藏中心(CCTCC，NO. M2010143)。

1.1.2 培養基(g/L) ①細菌活化培養基(NA)：牛肉膏3，NaCl 5，蛋白胨10，瓊脂18，蒸餾水定容至1 L，pH 7.2。②細菌種子液培養基(液體LB)：酵母膏5，胰蛋白胨10，NaCl 10，蒸餾水定容至1 L，pH 7.2。③計數培養基(固體LB)：酵母膏5，胰蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂18，蒸餾水定容至1 L，pH 7.2。

1.1.3 主要儀器與設備 光照恒溫搖床(TS-211GZ，上海儀純實業有限公司)；超凈工作臺(SW-CJ-2D，上海旌派儀器有限公司)；pH計(JB/T 7815，梅特勒-托利多儀器有限公司)；水浴鍋(JK-WB-20B，上海精學科學儀器有限公司)；高壓滅菌鍋(HVE-50，南京博惠科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化 取出保存于-80 ℃的菌種HR10，使用接種環采用平板劃線法將原種液接種在LB固體平板上，28 ℃培養24 h。然后挑取單菌落接種在裝液量為50/250 mL的NA培養基中，28 ℃，200 r/min培養18 h[24]。

1.2.2 種子液的制備 取活化后的菌液以1%(體積分數)的接種量接種于LB液體培養基中，LB培養基裝液量50/250 mL，28 ℃，200 r/min培養18 h后備用。

1.2.3 活菌與芽孢的計數 采用稀釋涂布平板計數法測定活菌量。取待測發酵液按稀釋10-1～10-8梯度，最后分別吸取10-6、10-7、10-8稀釋液200 μL于已靜置24～48 h的LB固體培養基上，用無菌刮鏟將稀釋菌液涂抹均勻，為防止在培養過程中被污染，將培養皿用封口膜密封后，28 ℃培養24～48 h，計數各培養皿菌落數。芽孢計數時，先將待測菌液80 ℃水浴10 min，只保留存活的芽孢，然后進行芽孢計數，其計數方法與活菌計數方法相同，芽孢率(%)=芽孢數/活菌數×100%[25]。

1.2.4 發酵液中不同培養時期芽孢率變化曲線的測定 使用初始LB液體培養基，在發酵培養的0、8、16、28、40、52、64、76、88、100 h分別測定發酵液中的活菌數和芽孢數。發酵培養液的接菌量為2%(體積分數)，裝液量50/250 mL，培養條件為28 ℃，200 r/min。

1.2.5 培養基優化 ①單因素篩選：a.最佳碳源及濃度的篩選：用葡萄糖、糖蜜、玉米粉、麥芽糖、淀粉、蔗糖等相等質量分別代替LB培養基中的碳源，250 mL三角瓶裝液量40%(體積分數)，接種量2%(體積分數)，200 r/min，28 ℃搖床培養64 h計數。測定每毫升活菌數和芽孢數并計算芽孢率。并將糖蜜和葡萄糖分別以0.3%、0.5%、0.8%、1%、2%、3%、4%、5%、8%、10%(質量分數)混合配制培養基，其他成分及培養條件不變，確定碳源濃度添加范圍。b.最佳氮源及濃度的篩選：生豆粉、豆粕粉、豆餅粉、魚粉、大豆蛋白胨、尿素含有氨基酸、酰胺和胺等可以被細菌轉化吸收合成蛋白質,核酸及含氮的代謝產物等可以作為有機氮源，硫酸銨、硝酸銨中的銨鹽可以直接被利用作為無機氮源[26]。將上述氮源等質量代替LB培養基中的氮源，確定最佳氮源，并將確定的氮源分別設置為0.3%、0.5%、0.8%、1%、2%、3%、4%、5%(質量分數)，其他成分不變，培養條件同①a，確定氮源濃度范圍。c.最佳無機鹽及濃度的篩選：林司曦等[24]研究結果表明，KCl對菌種HR10生長具有明顯促進作用，選用KCl作為其中一種確定的無機鹽并探索其最佳濃度，再分別添加0.1%(質量分數)的K2HPO4·3H2O、MnSO4、NaCl、FeSO4·7H2O、CaCO3、KH2PO4、FePO4·4H2O、ZnSO4、MgSO4·7H2O等無機鹽，培養條件同①a，確定最佳無機鹽種類，并將確定的無機鹽分別設置為0.3%、0.5%、0.8%、1%、2%、3%、4%、5%(質量分數)，添加①a、①b篩選出的最佳碳氮源，培養條件同①a，確定無機鹽濃度添加范圍。以上每個處理均進行3次生物學重復。②培養基優化的正交試驗：根據單因素試驗篩選出的培養基最佳碳源組合、氮源和無機鹽的種類和濃度(質量分數)，設計正交試驗L9(33)(表1)配制不同培養基進行菌株HR10搖床培養試驗，培養條件同①a，每個處理3次生物學重復。

表1 碳源、氮源和無機鹽優化的正交試驗因素與水平Table 1 Orthogonal test factors and levels for optimization of carbon source,nitrogen source and salt inorganic salt

1.2.6 培養條件優化 選擇正交試驗優化的培養基，對溫度、初始pH值、接種量、裝液量、轉速5個因素依次進行單因素試驗，確定最佳發酵條件。每個處理均進行3次生物學重復。

2 結果與分析

2.1 芽孢生長曲線的繪制

圖1為在最佳培養基和最佳發酵條件確定之前進行的發酵試驗數據，從圖1可以看出，菌株 HR10活菌數總體都不高，且呈現先升高再下降的趨勢，可能因為營養物質逐步被消耗，活菌數在發酵28 h時，達到最大值為3.9×109cfu/mL，最高芽孢率出現在76 h，但是，最高芽孢數量則出現在64 h，為3.9×108cfu/mL，說明營養體達到最大值后隨時間推移逐步減少，而芽孢則逐漸增多。因此，選取芽孢數量最大的時刻即64 h作為后續試驗的芽孢量測定時間點。

圖1 不同時間的活菌數、芽孢數和芽孢率Fig.1 The number of bacteria, spores and spore formation rate at different times柱形圖小寫字母表示數據之間存在顯著性差異，下圖同Lowercase letters in the column chart indicate significant differences between the data, the same as in the figure below

2.2 培養基單因素篩選結果

2.2.1 最佳碳源篩選 由圖2可知，在不同的碳源培養基中，添加葡萄糖和糖蜜的培養基所獲得的活菌數和芽孢數均顯著高于其他碳源培養基，活菌數分別達9.39×109cfu/mL和9.26×109cfu/mL，芽孢數分別為6.01×109cfu/mL和61.3×109cfu/mL。雖然蔗糖培養基的芽孢率最高，但因為其活菌數和芽孢數均較少，所以不宜作為目標碳源。玉米粉芽孢率低，也不作為目標碳源。葡萄糖和糖蜜兩者差異不明顯，且均具有較高的芽孢率。綜合考慮，本研究將葡萄糖和糖蜜按質量比1∶1添加，作為組合碳源。

圖2 不同碳源對菌株HR10活菌數、芽孢數和芽孢率的影響Fig.2 The number of living bacterium, spores and spore formation rate of HR10 strains with different carbon source

2.2.2 最佳氮源篩選 由圖3可知，在不同氮源培養基中，添加無機氮源的培養基中活菌數和芽孢數顯著低于添加有機氮源的培養基，說明菌株HR10不能有效地利用無機氮源。添加豆制氮源的培養基明顯好于其他種類氮源的培養基，其中添加豆餅粉的培養基中活菌數和芽孢數最高，分別為5.06×109cfu/mL和4.05×109cfu/mL，芽孢率可達70.94%。因此，選擇豆餅粉作為最佳氮源。

圖3 不同氮源對菌株HR10活菌數、芽孢數和芽孢率的影響Fig.3 Different nitrogen source medium HR10 strain number of living bacterium, the rate of spore number and spore

2.2.3 最佳碳源濃度篩選 由圖4可知，在不同濃度糖蜜和葡萄糖培養基中，濃度1%時的活菌數和芽孢數最高，分別達到9.89×109cfu/mL和7.68×109cfu/mL，但芽孢率則是在濃度為0.8%時達到最大，且隨濃度增加呈現逐步遞減的趨勢。因此，選取組合碳源濃度0.80%、1.00%、2.00%做三個水平的正交試驗。

圖4 不同濃度碳源對菌株HR10活菌數、芽孢數和芽孢率的影響Fig.4 Viable bacterial count, spore count and spore rate of HR10 strains in different carbon source concentrations

2.2.4 最佳氮源濃度篩選 由圖5可知，菌株 HR10的活菌數和芽孢數隨著培養基中豆餅粉濃度的增加逐漸增大，當豆餅粉濃度3.00%時最高，分別為1.12×1010cfu/mL和9.48×109cfu/mL，隨后逐漸下降。芽孢率變化不大，均在80%左右。因此，選取2.00%、3.00%、4.00%作為正交試驗的三個水平。

圖5 不同濃度氮源對菌株HR10活菌數、芽孢數和芽孢率的影響

2.2.5 最佳KCl濃度篩選 由圖6可知，芽孢率隨著KCl濃度升高而逐漸升高，當濃度為0.3%時，活菌數和芽孢數達到最大為1.31×1010cfu/mL和1.05×1010cfu/mL，隨后活菌數和芽孢數逐步下降，因此，選擇濃度為0.3%的KCl作為一種固定無機鹽進行添加。

圖6 不同濃度KCl對菌株HR10活菌數、芽孢數和芽孢率的影響

2.2.6 最佳無機鹽種類的篩選 由圖7可知，菌株HR10在聚乙烯醇培養基中的芽孢率僅為37.55%，顯著低于添加其他無機鹽的培養基。在添加了不同種類無機鹽的培養基中，以MnSO4的培養基所產生的活菌數、芽孢數和芽孢率均最大，分別為2.71×1010cfu/mL、2.47×1010cfu/mL和91.50%。在添加了K2HPO4·3H2O 的培養基中，雖然其活菌數量最大，但因其芽孢率較低，僅為4.01%，故不作為備選無機鹽。綜合分析，選擇MnSO4作為 菌株HR10的發酵培養基的無機鹽。

圖7 不同無機鹽種類及聚乙烯醇對菌株HR10活菌數、芽孢數和芽孢率的影響Fig.7 Different types of inorganic salt and polyvinyl alcohol medium HR10 strain number of living bacterium, the spore number and the rate of spore

2.2.7 最佳無機鹽濃度的篩選 由圖8可知，當MnSO4濃度0.2%～0.5%時，菌株HR10的芽孢數差異不顯著，但0.4%時，活菌數最大，為1.40×1010cfu/mL，所以選擇MnSO4濃度為0.3%、0.4%、0.5%作為后續正交試驗的三個水平。

圖8 不同濃度MnSO4對菌株HR10活菌數、芽孢數和芽孢率的影響Fig.8 The viable count, spore count and spore rate of HR10 strain in different MnSO4 concentration media

2.3 發酵培養基基質組成的正交試驗結果

由正交試驗結果(表2)可知，對菌株HR10芽孢產量影響最大的是葡萄糖和糖蜜等質量混合添加的組合碳源，其次是MnSO4，最后為豆餅粉，對應的最佳濃度組合為A2B1C2，即葡萄糖1%，糖蜜1%，豆餅粉2%，無機鹽MnSO40.4%，芽孢數可達1.78×1010cfu/mL。

表2 碳源、氮源和無機鹽優化的L9(33)正交試驗結果Table 2 L9(33)orthogonal test results optimized for carbon source,nitrogen source and inorganic salt

2.4 培養條件單因素優化結果

2.4.1 最佳培養溫度篩選 由圖9可知，隨著溫度的升高，活菌數和芽孢數呈現先減少后增多的趨勢。溫度為37 ℃時，活菌數和芽孢數均達到最大，分別為1.48×1010cfu/mL和1.43×1010cfu/mL。因此，選擇37 ℃作為菌株HR10搖瓶培養的最佳發酵溫度。

圖9 不同溫度對菌株HR10活菌數、芽孢數和芽孢率的影響

2.4.2 最佳pH的篩選 由圖10可知，在不同的pH培養基中，菌株HR10產生的菌數和芽孢數明顯有不同，pH 7時，活菌數和芽孢數最高，分別為1.74×1010cfu/mL和1.64×1010cfu/mL，芽孢率達到94.22%。說明菌株HR10在中性的環境下更適合生長。因此，選用pH 7作為菌株HR10搖瓶培養的最佳pH。

圖10 不同pH對菌株HR10活菌數、芽孢數和芽孢率的影響Fig.10 Viable bacterial count, spore count and spore rate of HR10 strain in different pH media

2.4.3 發酵容器最佳裝液量篩選 由圖11可知，發酵容器不同的相對裝液量對菌株HR10的活菌數有較大的影響，30%裝液量時，活菌數達到最大，為3.79×1010cfu/mL,50%裝液量時，芽孢率和芽孢數分別達到89.59%和 1.74×1010cfu/mL，說明50%裝液量時的氧氣濃度更有利于芽孢形成。因此，選擇菌株HR10搖瓶培養的最佳裝液量為50%。

圖11 培養基不同裝液量對菌株HR10活菌數、芽孢數和芽孢率的影響Fig.11 Viable bacterial count, spore count and spore rate of HR10 strains in different media with different liquid volume

2.4.4 最佳接種量篩選 由圖12可知，接種量5%時，芽孢數最高，為1.99×1010cfu/mL，但接種量超過5%時，芽孢數顯著下降，活菌數隨接種量增加而逐漸增高，接種量15%時，達到最高為3.59×1010cfu/mL。因為芽孢數是發酵產品的最重要指標，所以確定菌株HR10搖瓶培養的最佳接種量為5%。

圖12 不同接種量對菌株HR10活菌數、芽孢數和芽孢率的影響Fig.12 Viable bacterial count, sporecount and spore rate of HR10 strains in different inoculum media

2.4.5 最佳培養轉速篩選 由圖13可知，隨著轉速的增加，菌株HR10的活菌數、芽孢數和芽孢率均逐漸升高，當轉速為220 r/min時，達到最大，分別為2.47×1010cfu/mL、2.35×1010cfu/mL和94.70%，超過220 r/min，則呈現下降趨勢，說明轉速比較高時，菌體可能發生細胞自溶現象。因此，選取220 r/min作為菌株HR10液體發酵的最佳轉速。

圖13 不同轉速對菌株HR10活菌數、芽孢數和芽孢率的影響Fig.13 Viable bacterial count, spore number and spore rate of HR10 strain in different speed culture media

2.4.6 最佳發酵時間篩選 由圖14可知，發酵液在培養24 h時，活菌數達到最大值，為2.60×1010cfu/mL，隨后出現急劇下降，在40 h時又開始增加，最后在52 h達到頂峰，之后緩慢下降。芽孢數隨著時間推移逐步增加，在52 h時達到最大，為2.37×1010cfu/mL，之后開始下降，芽孢率在52 h達到最大，為94.46%，所以選擇最佳培養時間為52 h。

圖14 最適培養基和培養條件下不同時間菌株HR10的活菌數、芽孢數和芽孢率Fig.14 The number of viable bacteria, spore number and spore rate of HR10 strain at different time under the optimal medium and culture conditions

3 討 論

本研究表明，短小芽孢桿菌HR10菌株的培養基最佳成分為葡萄糖1%、糖蜜1%、豆餅粉2%、KCl 0.3%、 MnSO40.4%。最佳發酵條件：溫度37 ℃、pH 7、250 mL三角瓶裝液量50%、接種量5%、轉速220 r/min、培養時間52 h。芽孢因其特殊結構具有極強的抗逆性，在活菌制劑工業中表現出極高的應用價值[27]。芽孢的形成主要是菌體遇到了惡劣的生存環境，如營養條件、環境因素等。在培養過程中合理的碳氮用量可以有效地促進芽孢形成，縮短芽孢產生的時間。劉春紅等[28]對枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)B201菌株的產孢培養基進行優化，確定了最佳培養基成分(g/L)：米粉3、糖蜜10、豆粕粉10、魚粉10、K2HPO42、Na2HPO42、MgSO40.5、MnSO40.5，大幅縮短了產孢培養時間，從而節省了能源，降低了成本。所以對有益微生物快速產孢培養基的研究以及微生物制劑的生產和應用都顯得至關重要。

本研究通過對短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)HR10菌株的最佳產孢和發酵培養基進行研究表明，葡萄糖和糖蜜組合碳源可以有效提高菌株HR10的產孢率，葡萄糖作為速效碳源可以使菌體快速生長，縮短發酵時間，糖蜜可以使菌體維持較高的芽孢率并且作為工業副產品價格低廉，適合作為培養基成分。不同氮源的篩選結果表明，無機氮源不利于HR10菌體生長及產孢，這與王繼雯等[29]的研究結果相同。相對于生豆粉和豆粕粉而言，豆餅粉對菌體產孢促進效果最好，可能與發酵過程中生豆粉產生大量氣泡從而使環境改變有關，而在豆粕粉作為氮源的培養基中，菌株HR10的活菌數和芽孢數低很可能是營養物質含量低所致。研究表明在培養基中添加適當的無機鹽離子可以有效促進芽孢形成[30]，如Mn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+和一些磷酸鹽類等，這主要與芽孢中含有的特殊成分吡啶二羧酸有關，其可以整合不同的二價陽離子形成螯合物使芽孢核心高度礦化脫水，使其具有抵抗高溫的能力[31]。本研究表明，Mn2+對菌株HR10產芽孢具有非常顯著的促進作用，Mn2+是多種酶的輔助因子[24]，Mn2+可以增加芽孢的產率，使其更加穩定，進一步改善芽孢的皮層結構，增加耐熱性，在制備微生態制劑過程中可以有效提高產品的質量，延長保存時間。同時，因本實驗結果選用的碳氮源多是工業副產品，使用成本得以大幅降低，有利于菌株HR10的工業化生產。

發酵條件也對細菌芽孢的產生具有一定的影響[32-33]，本研究在進行溫度單因素試驗時發現，25 ℃相對于28 ℃和32 ℃，可使菌株HR10具有更高的活菌數和芽孢數，這可能是因為B.pumilusHR10是一種植物根際促生細菌，相對的低溫更加有利于其生長。35～37 ℃時又增高，37 ℃達到最大，說明溫度對芽孢數和活菌數有一定的影響。初始pH在細菌培養的初始階段則顯得更加重要，合適的pH值可以使菌體在指數期更加快速的生長，活菌數量的峰值更高，如杜冰等[34]研究發酵培養芽孢乳酸桿菌(Lactobacillussporogenes)D-1表明，pH 7比pH 2時最終活菌數高出了6個數量級。過高的轉速使自溶酶(autolysin)釋放，溶解細菌胞壁質，造成細胞內容物釋放，發生細胞的自溶現象，pH、溫度也對細胞自溶有一定的影響[27]。

固體菌劑常用的干燥方法有噴霧干燥、流化床干燥、真空干燥、真空冷凍干燥、噴霧冷凍干燥法等。由于冷凍干燥的高成本和能量消耗，使噴霧干燥制備固體菌劑的研究更為廣泛[35]。由于培養物在干燥期間存活率低，貯存期間穩定性低等缺點[36-38]，而芽孢因其極強的抗逆性，因此，提高培養物芽孢數量和芽孢率在固體菌劑的制備和儲存過程中有極其重要的作用，對生防菌大面積推廣具有深遠意義。